МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РФ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР ТОКСИКОЛОГИИ И

ГИГИЕНИЧЕСКОЙ РЕГЛАМЕНТАЦИИ БИОПРЕПАРАТОВ

(ФГУН НИЦ ТБП ФМБА)

УТВЕРЖДАЮ:

Директор НИЦ ТБП, д. м.н.,профессор

__________________

“______”_______________ 2011 г.

ОТЧЕТ

Экспериментальное изучение воздействия лекарственной субстанции фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат на генеративную функцию крыс при внутрижелудочном введении

Руководитель исследования,

научный сотрудник отдела патоморфологии

и репродуктивной токсикологии

"____"_____________ 2011 г.

Серпухов 2011

СПИСОК ИСПОЛНИТЕЛЕЙ

Научный сотрудник
Лаборант-исследователь
Лаборант-исследователь
Лаборант-исследователь
Лаборант-исследователь
Лаборант-исследователь

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ	5
1. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ	5
1.1. Общие условия проведения исследования	5
1.2. Изучение влияния лекарственной субстанции фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата на генеративную функцию (фертильность) самцов	8
1.3. Изучение влияния субстанции фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата на генеративную функцию (фертильность) самок.	10
2.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ	11
2.1. Результаты исследования токсического действия субстанции фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат на гонады самцов морфо-функциональными методами	11
2.2. Результаты исследования репродуктивной функции крыс при спаривании самцов, получавших субстанцию фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат, с нелеченными самками	12
2.3. Результаты исследования репродуктивной функции крыс при спаривании самок, получавших субстанцию фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат, с нелеченными самцами	15
ЗАКЛЮЧЕНИЕ	18
ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Индивидуальные покзатели массы тела крыс	19
ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Индивидуальные показатели эмбриотоксического действия в антенатальном периоде	25
ПРИЛОЖЕНИЕ 3. Индивидуальные показатели эмбриотоксического действия в постнатальном периоде	27

РЕФЕРАТ

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

Объем отчета – 18 страниц, таблиц – 13, приложений – 3 на 10 страницах.

Ключевые слова: фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат, генеративная функция, внутрижелудочное введение, крысы Wistar

Целью исследования явилась экспериментальная оценка возможного токсического действия лекарственной субстанции фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат на генеративную функцию крыс при внутрижелудочном введении.

Фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат вводили самкам крыс в течение 15 дней, самцам – в течение 70 дней. Леченных животных спаривали с интактными и оценивали течение беременности, антенатальное и постнатальное развитие потомства, а также проводили оценку сперматогенеза морфо-функциональными методами.

Проведенным исследованием не установлено токсического воздействия лекарственной субстанции фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат на генеративную функцию крыс (фертильность) при внутрижелудочном введении в дозах до 30 мг/кг массы тела.

ВВЕДЕНИЕ

Субстанция фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат представляет собой производное фуллерена и аминокапроновой кислоты. Субстанция нерастворима в воде, поэтому для ее растворения используют диметилсульфоксид (ДМСО), с последующим разведением водой до необходимой концентрации.

Фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат исследовали в двух дозах – 3,0 и 30,0 мг/кг. Контрольной группе животных внутрижелудочно вводили водный раствор ДМСО.

1. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Общие условия проведения исследования

Регулирующие стандарты

Исследование выполнено согласно следующим документам:

ОАО

Тестируемое вещество

Фуллерен-(трисаминокапроновая кислота) гидрат

Производитель:

Физико-химические свойства:

Формула: С 60 (H)n (NH(CH2)5COOH) 1-6 • 10 Н2О

Описание: Субстанция представляет собой кристаллическое вещество от коричневого до темно-коричневого цвета.

Физические свойства: температура разложения без плавления 400-450 °С

Растворимость:

• Легко растворим в ДМСО (диметилсульфоксиде)

• Растворим в диметилформамиде ( 10 мг субстанции в 10 мл ДМФ)

• Практически не растворим в воде, 95% этиловом спирте, 1,2-
дихлорбензоле

рН: 5,2

Аминокапроновая кислота: 3 - 3,5 %

Хлориды: не более 0,2%

Общая зола: не более 0,5%

Тяжелые металлы: не более 0,001 %

Остаточные растворители: 1,2-дихлорбензол – не более 0,036%

Содержание азота: 4,5 %

Элементный анализ:

%С – 73,30

%Н – 4,10

%N – 4,60

%С1 – 0,2

Контрольное вещество (носитель)

Название: диметилсульфоксид (ДМСО)

Хранится при 4оС.

Прописи приготовления растворов фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата для введения животным:

1. Приготовление 100 мл раствора фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата с концентрацией 4,0 мг/мл:

400 мг фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата растворить в 20 мл ДМСО. После растворения субстанции объем раствора довести до 100 мл дистиллированной водой.

2. Приготовление 100 мл раствора фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата с концентрацией 0,4 мг/мл:

40 мг фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата растворить в 20 мл ДМСО. После растворения субстанции объем раствора довести до 100 мл дистиллированной водой.

Пропись приготовления контрольного вещества (растворителя):

К 20 мл ДМСО добавить дистиллированную воду до объема 100 мл.

Животные

Вид: крыса (Rattus sp.)

Линия/сток: Wistar

Поставщик: РАМН, НЦБТ филиал "Андреевка"

Условия содержания

Животных содержали в отдельной комнате при температуре 20-22°С и относительной влажности воздуха 50-60%. В течение экспериментов соблюдали 12 часовой цикл освещения день-ночь и обеспечивали 15-ти кратную смену объема воздуха комнаты в час Основные правила содержания и ухода соответствовали нормативам "Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев), утвержденным МЗ СССР 06.07.73 г., а также условиям, приведенным в Руководстве "Guide for Care and Use of Laboratory Animals" (ILAR publication, 1996, National Academy Press, USA).

Клетки

Крыс размещали в клетках из поликарбоната (Тип-4) на стеллажах из нержавеющей стали фирмы LabProdex USA. Клетки были оборудованы стальными решетчатыми крышками с углублением, стальными разделителями для корма и стальными держателями этикеток.

Подстил

В качестве подстила использовали древесные опилки смешанных пород деревьев. Толщина слоя подстила в клетке ― 15-20 мм.

Корм

Для кормления животных применяли стандартный экструдированный корм фирмы OOO "Лабораторкорм" (Россия). Корм для свободного неограниченного доступа давали в кормовое углубление стальной решетчатой крышки клетки.

Вода

Животные получали воду, соответствующую ГОСТу "Вода питьевая" 28.74–73, в стандартных автоклавированных питьевых бутылочках со стальными крышками-носиками.

Карантин или адаптация

Закупленных животных до начала исследования содержали 7 дней для адаптации при групповом содержании в клетках. Во время этого периода у животных дважды в день контролировали клиническое состояние путем визуального осмотра.

Получение животных с известным сроком беременности

Чтобы получить крыс с известным сроком беременности, с вечера самцов подсаживали к самкам (1 самец на 2 самки). Утренние влагалищные мазки анализировали под микроскопом. Факт спаривания устанавливали по наличию влагалищной пробки или присутствию сперматозоидов в мазке. День, когда факт оплодотворения был установлен, считали 1 днем беременности.

Распределение по группам

Каждый день, когда проводилось определение результатов спаривания, всех самок с подтвержденным фактом спаривания делили в примерно равном количестве по экспериментальным группам. Животных распределяли по группам рандомизированно, используя в качестве основного критерия массу тела, так, чтобы различия в массе тела между особями в одной группе не превышали 20%.

Идентификация животных

Во всех экспериментах крысам присваивали индивидуальные номера, которые наносили несмываемым маркером ближе к корню хвоста с дорсальной стороны. Индивидуальные номера отображали на карточке клетки, где содержали животных.

1.2. Изучение влияния субстанции фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат на генеративную функцию (фертильность) самцов

Фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат вводили самцам внутрижелудочно ежедневно в течение 70 дней (полный цикл сперматогенеза) в дозах 3,0 мг/кг и 30,0 мг/кг массы тела. По окончании указанных курсов введения леченных животных спаривали с интактными. На 20-й день беременности половину спаренных самок подвергали эвтаназии для определения аномалий и пороков развития потомства, выявляемых в антенатальном периоде. Оставшимся давали родить и наблюдали за развитием потомства.

По окончании спаривания было проведено морфо-функциональное исследование функции сперматогенеза по показателям:

· массовый коэффициент семенников,

· время подвижности сперматозоидов,

· среднее число сперматозоидов,

· неподвижные формы сперматозоидов,

· патологические формы сперматозоидов,

· индекс сперматогенеза,

· относительное число канальцев с 12-й стадией мейоза,

· среднее число сперматогониев в 1 канальце.

Для изучения аномалий и пороков развития, выявляемых в антенатальном периоде, беременных самок подвергали эвтаназии и проводили их вскрытие. При вскрытии брюшной полости устанавливали наличие беременности. В случае подтверждения беременности извлекали матку с яичниками и определяли:

· количество желтых тел в яичниках

· общее количество плодов

· общее количество имплантаций

· количество живых и мертвых плодов

· количество ранних или поздних резорбций

· массу каждого плода

· кранио-каудальный размер каждого плода

· пол каждого плода

· внешние отклонения в развитии или наличие уродств у плодов

После визуального осмотра примерно половину плодов из каждого помета помещали в 96о этанол и использовали для последующего изучения состояния скелета (окрашивание ализарином по методу Доусона в модификации НИИЭМ АМН СССР). Вторую половину плодов помещали в жидкость Буэна, для последующего изучения внутренних органов по методу Вильсона в модификации НИИЭМ АМН СССР.

Матки животных, в которых при вскрытии не было выявлено плодов или различимых мест имплантации, извлекали и окрашивали сульфидом аммония по Salewski для визуализации возможных мест имплантации (ранних полных резорбций).

В постнатальном периоде отмечали такие показатели рожденного потомства: масса и кранио-каудальный размер, смертность за первый месяц, а также показатели двигательной и эмоциональной активности крысят.

1.3. Изучение влияния субстанции лекарственного препарата фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата на генеративную функцию (фертильность) самок.

Фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат вводили внутрижелудочно самкам крыс в течение 15 дней (3 эстральных цикла) в дозах 3 и 30 мг/кг. В каждую группу было взято по 20 самок.

По окончании введения препарата самок спаривали с интактными самцами, после чего половину самок забивали на 20-й день для определения аномалий и пороков развития плодов, выявляемых в антенатальном периоде, а оставшимся давали родить и наблюдали за развитием потомства.

Для изучения аномалий и пороков развития плодов, выявляемых в антенатальном периоде, на 20 сутки после спаривания беременных самок подвергали эвтаназии и проводили их вскрытие. При вскрытии брюшной полости устанавливали наличие беременности. В случае подтверждения беременности извлекали матку с яичниками и определяли:

· количество желтых тел в яичниках

· общее количество плодов

· общее количество имплантаций

· количество живых и мертвых плодов

· количество ранних или поздних резорбций

· массу каждого плода

· кранио-каудальный размер каждого плода

· пол каждого плода

· внешние отклонения в развитии или наличие уродств у плодов

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Результаты исследования токсического действия фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата на гонады самцов морфофункциональными методами

Субстанцию препарата вводили самцам крыс в течение 70 дней (полный цикл сперматогенеза). В каждой группе было по 10 животных. При клиническом наблюдении за животными в период введения препарата не было отмечено каких-либо признаков патологии, масса тела подопытных животных не отличалась от массы тела контрольных животных (табл. 1).

Таблица 1

Масса тела самцов крыс на протяжении периода внутрижелудочного

введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата

День эксперимента	Доза (мг/кг)
ДМСО	3,0	30,0
1	277,9±12,3	275,1±14,6	280,3±12,7
7	308,4±12,7	305,0±15,9	310,6±12,6
14	329,5±11,3	326,5±16,3	330,6±11,0
21	342,3±10,8	342,5±14,9	343,6±13,1
28	360,7±10,9	356,1±17,6	360,7±14,6
35	377,9±14,2	364,5±16,6	369,9±14,5
42	392,9±17,3	375,3±16,9	382,9±14,2
49	406,1±18,0	384,5±17,0	394,1±14,6
56	418,8±18,1	397,5±19,7	404,2±13,5
63	425,8±19,2	403,7±17,8	410,7±13,7
70	419,3±18,8	391,4±18,1	403,4±14,7

По окончании курса введения самцов спаривали с интактными самками, а затем проводили эвтаназию, отсекали семенники, с одним из которых проводили исследование по оценке сперматогенеза в нативных препаратах, а второй фиксировали в жидкости Буэна для последующего приготовления гистологических препаратов.

Результаты изучения морфофункционального состояния семенников представлены в таблице 2.

Таблица 2

Морфофункциональные показатели состояния семенников крыс после 70 дней внутрижелудочного введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата

Показатель	Доза (мг/кг)
ДМСО	3,0	30,0
Массовый коэффициент семенников	8,0 ± 0,4	7,9 ± 0,2	8,2±0,3
Время подвижности сперматозоидов, мин	240± 54	275 ± 63	211±47
Среднее число сперматозоидов, млн.	27,4 ± 2,1	29,5 ± 2,7	23,7±4,9
Неподвижные формы сперматозоидов, %	12,3 ± 2,6	13,6 ± 1,9	9,9±1,8
Патологические формы сперматозоидов, %	26,8 ± 2,8	21,4 ± 4,2	29,4±3,5
Индекс сперматогенеза	3,6 ± 0,2	3,4 ± 0,3	3,6±0,2
Число канальцев со слущенным эпителием, %	0,2 ± 0,1	0,2± 0,1	0,2±0,1
Относительное число канальцев с 12-й стадией мейоза, %	1,3±0,3	1,5±0,4	1,2±0,2
Среднее число сперматогониев в 1 канальце	57,4 ± 2,6	60,6 ± 3,7	61,2±2,4

Как следует из приведенных в таблице данных, введение фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата самцам крыс не оказало влияния на процесс сперматогенеза и морфофункциональное состояние семенников.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

ОТЧЕТ

ВВЕДЕНИЕ

1. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Масса тела самцов крыс на протяжении периода внутрижелудочного

введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата

Домашний очаг

Справочная информация

Техника

Общество

Образование и наука

Мир

Бизнес и финансы