Методическое пособие
Протеомные исследования в биологии и медицине
План:
Введение
История
Протеомика в биологии
Протеомика в медицине
Методы
Заключение, перспективы
Введение
Термин «протеом», обозначает весь белковый комплемент, экспрессируемый геномом – “PROTEOME: entire PROTEin complement expressed by genOME”. Протеомика – это системное изучение «протеома», то есть всех белков, синтезирующихся в клетке или другом объекте (органе, организме). Высокая значимость каждого из индивидуальных белков для обеспечения тех или иных функций и/или молекулярных структур в организме не только определяет их вовлеченность в различные физиологические и патологические процессы с потенциальными возможностями для использования белков в качестве эффективных диагностических маркеров, но и для применения некоторых белков как лекарственных средств. Для обнаружения и исследований новых белков широко применяются новые технологии, которые после завершения международного проекта «Геном человека» принято называть постгеномными. В частности, для системных исследований информационных РНК (транскриптов) используют термин «транскриптомика», а для системных исследований белков – «протеомика». Освоение и использование геномных и постгеномных технологий позволяет вывести молекулярно-биологические исследования, направленные на решение медицинских вопросов, на качественно более высокий уровень.
Традиционные подходы к изучению индивидуальных белков – биохимический и иммунохимический ориентируются на последовательное изучение отдельных белков. Для достижения цели белки изучают (выделяют), используя их индивидуальные свойства – функциональную активность или антигенность. В тоже время, системный подход ориентируется на параллельное изучение многих индивидуальных белков, совокупность которых составляет определенную систему, что характеризует исследуемый объект в целом. Рисунок 1 демонстрирует различие в разрешающей способности между одномерным электрофорезом (разделение смеси белков по разнице в их молекулярных массах) и комплексным методом – двумерным электрофорезом. Двумерный электрофорез в состоянии выявить в несколько раз больше индивидуальных белков, по сравнению с одномерным.
|
|
Рис. 1. Сравнение результатов одномерного (А) и двумерного (Б) форезов мембранных белков эритроцитов человека. Результат: одномерный форез выявил около 30, а двумерный – 189 белков.
История
В 20 веке методы аналитической химии прогрессировали от простых процедур, имеющих дело с единичными элементами, к более сложным методам, основанным на физическом разделении и детекции веществ. Таким образом, уже более 50 лет назад большое внимание уделялось методам разделения частиц – хроматографии, электрофорезу, масс-спектрометрии. Несколько позднее изобрели капиллярный электрофорез (гг.). Из всех этих методов только масс-спектрометрия обеспечивала разрешение, достаточное для разделения и идентификации сложных элементных смесей, однако до недавнего времени, и она не могла адекватно разделять макромолекулы. Задавшись целью увеличить разделительную способность, ученые пришли к выводу о необходимости совместить в двух измерениях два каких-либо метода, основанных на измерении разных параметров. Изначально предлагалось использовать два различных растворителя при разделении молекул в процессе хроматографии на бумаге, а также предпринимались попытки совместить электрофорез, в качестве первого направления с хроматографией, в качестве другого. Эта же концепция также имела место при разделении молекул по седиментационным коэффициентам и по различиям в плотности при ультрацентрифугировании. Если два метода разделения независимы друг от друга, то финальное разрешение должно определяться суммой разрешения обоих методов. В принципе, можно было бы добавить более двух измерений, однако такой подход может привести к значительному падению концентрации исследуемого вещества и к возникновению проблем в детекции сигнала.
По крайней мере шесть независимых попыток разработать двумерный электрофоретический метод было предпринято, прежде чем в 1975-76 гг. была опубликована первая доступная весия метода, объединяющая изоэлектрофокусирование (ИЭФ) в растворах мочевины с электрофорезом в присутствии йонного детергента додецилсульфата Na (SDS). Разделение проводилось по первому направлению на основе заряда денатурированных белков (зависит от аминокислотной последовательности), а по второму направлению – в зависимости от молекулярной массы (см. раздел Методы).
В течение прошедших с тех пор 30 лет метод подвергался многим дополнениям, в частности, была предложена идентификация разделенных белков с помощью микросеквенирования и масс спектрометрии. Создаются компьютерные базы данных, содержащие сведения о клетках в культуре, белках плазмы крови, белках печени мыши и крысы, E. Coli, дрожжей и других модельных объектах. Практическое расширение области используемых pH связано с использованием коммерческих наборов иммобилинов, то есть иммобилизованных на специальных стрипах амфолинов. Использование таких наборов увеличивает воспроизводимость и увеличивает область действия метода. Иммобилиновая система позволяет использовать значительные нагрузки по белку: 1-10 мг на полоску (обычная нагрузка составляет около 100 мкг белка) и обеспечивает возможность изучения белков с рН > 8,5.
2Д электрофорез заложил основу для расшифровки молекулярного строения человеческих и животных тканей, клеток, бактерий и вирусов и для детектции изменений, происходящих при развитии, старении, заболеваниях а также в ответ на изменения окружающей среды. Протеомные методы используются для определения маркеров заболеваний и разработки новых лекарств. Также комбинация 2Д электрофореза с фракционированием клеточных органелл может дать информацию о внутриклеточной локализации специфических белков. Метод должен отличаться воспроизводимостью и возможностью количественной оценки результатов. В идеальном случае, должна быть возможность автоматизации всего набора процедур. До сих пор не существует полностью автоматизированного 2Д электрофореза, в связи с тем, что процедуры, входящие в него очень трудоемки.
Интересный аспект истории 2Д электрофореза показан на рис. 2, представляюшем число публикаций, найденных по запросу: 2Д электрофорез и протеомика. В последние 10 лет число статей, посвященных 2Д электрофорезу стабилизировалось и вышло на плато. С чем это связано - с тем, что 2Д электрофорез выходит из моды? Или это объясняется теми успехами секвенирования генома, которые наблюдаются в последние годы? Однако, даже если представить себе полностью расшифрованные геномы всех без исключения живых существ, протеомика будет иметь право на существование, так как связывает продукты деятельности генов с функциями организма. В последние несколько лет термин «протеомика» очень часто встречается среди цитируемых статей (рис. 2)
Рис. 2. Число публикаций, посвященных 2Д электрофорезу (2D or two D) и протеомике (proteom*) в базе данных MEDLINE c 1975 по 2005 гг.
Протеомика в биологии
Расшифровка генотипа организмов открывает перед учеными перспективу открытия базовых различий между хозяином и паразитом, между нормальной и необластической клетками. Знание этих различий приводит к пониманию причин генетических заболеваний, и, соответственно, к возможности лечения и предупреждения их.
Эпигенетическая система отражает взаимодействие организма с окружающей средой, а также взаимодействия между генами и продуктами их деятеьности. Эти взаимодействия могут быть прямыми (рис. 3) или осуществляться посредством сложной сети взаимодействий на белковом уровне (рис. 4) В последнем случае, наличие дефекта в гене может приводить или не приводить к заболеванию; кроме этого, степень и тяжесть заболевания может изменяться в зависимости от индивидуума. В эти сложные взаимодействия также включается воздействия окружающей среды на организм.
Рис. 3. Схематическое изображение системы, в которой между генотипом и фенотипом существуют только прямые взаимодействия
Рис. 4. Схематическое изображение системы в которой между генотипом и фенотипом существуют комплексные взаимодействия на белковом уровне. Х –гипотетическое лекарственное средство; стрелки справа означают регуляторное воздействие лекарственного средства на фенотип (стрелка вверх – усиление экспрессии, стрелка вниз – подавление экспрессии специфические белки).
Известно, что только 2% болезней человека вызваны действием одного гена. Оставшиеся 98% заболеваний являются поли - или эпигенными по своей природе. Из этого утверждения следует то, что ни один ген не может действовать в одиночку. Он действует только в связи с другими генами а также с окружением. Гены могут экспрессироваться по-разному в разных организмах, а также ингибировать друг друга (явление, называемое эпистаз). Таким образом, для большинства полигенных заболеваний невозможно предсказать фенотип, исходя только из данных расшифровки генома.
Клетка реагирует на изменения внешней среды изменением ее белкового состава. В ответ на внешнее воздействие синтез одних белков увеличивается, других – уменьшается. Таким образом, фенотип не линейно зависит от проявлений генотипа, так как системы эпигенеза контролируют и модифицируют экспрессию генов. Практически все элементы эпигенетической системы – белки.
Молекулярный фенотип живой клетки невероятно лабилен. Многие белки имеют своей основной функцией перенос информации. Не существует фиксированного синтеза того или другого белка, поэтому концентрация белков в клетке изменяется. При обработке клетки гормонами, токсинами или лекарствами, количественные изменения наблюдаются не в одном, а в целом ряде белков. Существует два типа регуляции: up - и down-. Клетки – реактивные системы, в которых информация передается не только от генов к белкам, но и противоположном направлении (рис. 5).
|
Рис.5. Схема взаимодействия генома с окружающей средой.
Элиминация единичного белка в организме (например, в Knock-out мыши) приводит к изменению всего молекулярного фенотипа целого организма. Более того, любое лекарство, которое воздействует на белок, например, на ионный канал, опосредованно влияет на белковый состав всего организма.
Степень гликозилирования определяет биофизические свойства и биологическую активность молекулы белка. Гликозилирование – это посттрансляционная модификация, поэтому оно является основой гетерогенности белковой популяции. Попытки охарактеризовать гетерогенную популяцию гликозилированных белков предпринимались с использованием капиллярного электрофореза в тандеме с масс-спектрометрией.
Протеомика в медицине
В клинической биохимии анализ индивидуальных белков человека используется для установления вида патологического процесса (дистрофии, опухолевый рост, воспаление) и определения пораженного органа (инфаркт миокарда);
- установления природы патологии, например, при диагностике энзимопатий, инфекционных (гепатит) и других заболеваний;
- оценки течения различных физиологических процессов (беременность, развитие иммунной системы) и обнаружения осложнений в их течении (патология беременности).
В области разработки лекарств основной проблемой, как правило, является увеличение или уменьшение активности белков, поэтому необходим некоторый метод, позволяющий регулировать специфическую активность. 2Д электрофорез является основным средством изучения воздействия лекарств на протеом, или на совокупность всех белков органа. Как правило новые лекарства тестируются с помощью 2Д электрофореза, на накопление их в критических органах, например, в печени.
Пример 1. Лекарство ловастатин, понижающее уровень холестерола в крови. Специфика его действия заключается в ингибировании HMG-кофермент А редуктазы. Однако, при анализе эффекта, которое оказывает это лекарство в комбинации с другими средствами, понижающими холестерол, было найдено, что количество белка HMG-Кофермент-A синтазы значительно повышается, в то время как количество других белков уменьшаются. Позднее обнаружили, что основное действие изучаемого лекарства заключается не в прямом ингибировании синтеза холестерола, а в повышении активности другого белка, липопротеинового рецептора, который удаляет из крови холестерин.
Пример 2. Превентивное лекарство против рака олтипраз повышает экспрессию ряда белков, включая афлатоксин В1 альдегидредуктазу, который разрушает один из натуральных канцерогенов. Предполагалось, что эффект имеет место в эндоплазматическом ретикулуме. При анализе 2Д геля, однако, выяснилось, что большинство изменений происходит в растворимой и митохондриальной фракциях клетки. Кроме этого, при сравнении экстрактов печени самок и самцов, экспрессия более трети белков отличалась в количестве. Следует заметить, что почти все эти различия регулируются на гормональном эпигенетическом уровне и не обусловлены наличием Х или У хромосомы.
Эти данные свидетельствуют о том, что экспрессия генов в тканях очень пластична, отвечает на воздействия большого числа факторов и почти всегда включает не один или два, а много генов. 2Д электрофорез идеально подходит для изучения подобных динамических изменений.
Как правило, результаты 2Д коррелируют с известными механизмами функционирования белков. Так, если лекарство усиливает пролиферацию в пероксисомах по данным электронной микроскопии, то и на 2Д электрофорезе будет наблюдаться увеличение количества белков, характерных для этого типа органелл. Подобные структурно-функциональные взаимодействия означают, что идентификация белков-мишеней для нового лекарственного средства может помочь открыть механизмы функционирования этих белков.
Еще одна важная функция 2Д методов в клинической протеомике это поиск новых белков-маркеров заболеваний, в частности, онко-маркеров. Отмеченные в таблице 1 потенциальные маркеры рака простаты представляют особый интерес по разным причинам. Например, тимозин бета-15 может определяться в моче и, по-видимому, имеет прямое отношение к молекулярным механизмам злокачественного перерождения клеток. Соответственно, ген тимозина бета-15 и его продукты могут стать не только диагностическими маркерами, но и в перспективе мишенями для различных воздействий с целью подавления опухолевого роста.
Таблица 1.
Название маркера | Значимость для диагностики рака простаты (РП) |
1. Белок AGR2 (AGR2) | Секреторный белок, андроген-индуцируемый, обнаружен в РП, гиперэксперессия в 89% случаев РП. Обнаруживается при других опухолях |
2. Простат-специфический мембранный антиген | Маркер с прогностической значимостью. Высокий уровень коррелирует со злокачественностью и метастазированием, но определяется и при аденоме |
3. Тимозин бета 15 | По иммуногистохимии – маркер с прогностической значимостью «Мочевой» маркер, что перспективно при организации скрининга Обнаруживается при других злокачественных опухолях. |
4. Белок Р63 | По иммуногистохимии – маркер с прогностической значимостью. |
5. Рацемаза (alpha-methylacyl CoA racemase, AMACR) | По иммуногистохимии – маркер с прогностической значимостью. |
6. Антиген простатных стволовых клеток (Prostate stem cell antigen, PSCA) | Маркер клеточных поверхностей, показана гиперэкспрессия гена при РП до 80%; высок уровень экспрессии при метастазах РП |
7. Высокомолекулярный цитокератин 34betaE12 (High-molecular-weight keratin 34betaE12) | По иммуногистохимии – маркер с прогностической значимостью. |
Методы
Комплексное изучение «протеома» проводится методами и технологиями, направленными на одновременное разделение, а также последующую идентификацию и анализ всех белков, синтезирующихся в клетке или другом объекте (органе, организме).
1. Изоэлектрофокусированием (ИЭФ) называют разработанный в начале 60-х годов метод разделения белков под действием электрического поля в среде с градиентом pH, который создается специальными амфотерными веществами – «амфолитами», способными переносить ток (хорошая проводимость), а также создавать локально и поддерживать рН (хорошая буферная емкость). Появление наборов полиамино-поликарбоновых кислот (амфолинов) обеспечило высокую эффективность фракционирования белков с помощью ИЭФ, при этом разделение осуществлялось за счет различий в pI.
2. Среди множества электрофоретических методов разделения белков наибольшая эффективность оказалась у особой модификации метода Лэммли для вертикальных пластин с градиентом концентрации полиакриламидного геля, использующего ионный детергент – додецилсульфат Na (SDS). За счет гидрофобных взаимодействий, используемый детергент практически одинаково связывается с подавляющим большинством белков в соотношении 1.4 мг SDS на 1 мг белка. Огромный избыток полностью диссоциированных остатков сульфокислоты делает несущественной роль заряда самого белка. Электрофоретическая подвижность комплекса белок-SDS в градиентном геле оказывается линейно связана с десятичным логарифмом его молекулярной массы (Mm). Таким образом, эта система обеспечивает разделение белков по различиям в Mm.
3. Идентификация миросеквенированием основана на определении (расшифровке) части аминокислотной последовательности белка. Разработанные методы микросеквенирования позволяют работать с очень малыми количествами пептидов - вплоть до нанограммовых. Это важно, так как определение даже короткого фрагмента аминокислотной последовательности часто оказывается решающим для идентификации целого белка. В настоящее время возможно как проведение прямого N-концевого секвенирования белка, перенесенного на инертную мемебрану, так и секвенирование отдельных пепетидов, полученных из изучаемого белка после его ферментативного расщепления высокоэффективной жидкостной хроматографией. Микросеквенирование позволяет выявлять одиночные аминокислотные замены в анализируеемых белках.
4. Масс-спектрометрия устанавливает какие атомы входят в состав молекулы, какова структура их расположения и изотопный состав, а также какова масса молекулы. Существенное отличие масс-спектрометрии от других аналитических физико-химических методов состоит в том, что оптические, рентгеновские и другие методы детектируют излучение или поглощение энергии молекулами или атомами, а масс-спектрометрия имеет дело с самими частицами вещества. Масс-спектрометрия измеряет соотношение массы частицы к заряду. Для этого используются законы движения заряженных частиц материи в магнитном или электрическом поле. Различают несколько модификаций масс-спектрометрических методов:
· Мягкая матриксная ионизация (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - MALDI) позволяет анализировать такие биополимеры, как полисахара, пептиды и макромолекулы, без риска повредить их структуру. Ионизация производится лазерным пучком, а матрикс используется для защиты молекул от разрушающего действия лазера. Матрикс состоит обычно из кристаллов кислот в смеси с органическим растворителем.
· Тандемная масс-спектрометрия (MS/MS) проводится на приборе, который объединяет несколько анализаторов, позволяющих последовательно изолировать один пептид, стабилизировать ионы, составляющие его и идентифицировать фрагменты. Используется в идентификации белковых пятен после 2Д электрофореза.
5. Капиллярный электрофорез - это метод анализа сложных смесей, использующий электрокинетические явления – электромиграцию ионов и других заряженных частиц и электроосмос – для разделения и определения компонентов. Эти явления возникают в растворах при помещении их в электрическое поле, преимущественно, высокого напряжения. Если раствор находится в тонком капилляре, например, в кварцевом, то электрическое поле, наложенное вдоль капилляра, вызывает в нем движение заряженных частиц и пассивный поток жидкости, в результате чего проба разделяется на индивидуальные компоненты. Модификацией метода является капиллярный электрофорез в чипах. Идентификация белков с помощью масс-спектрометрии может проводиться непосредственно после разделения.
6. Недавно был аннонсирован метод капиллярного изоэлектрофокусирования. После изофокусирования в канале чипа, покрытого специальной пленкой, чип замораживался, пленка удалялась и содержимое канала подвергалось высушиванию при критической точке для предотвращения изменения позиции белковых пятен. После этого матрикс для MALDI добавлялся непосредственно к содержимому чипа. В результате одновременно удавалось считывать информацию о молекулярном весе и изоэлектрической точке данного пептида.
7. Двумерный электрофорез:
При исследовании белков методом 2Д электрофореза, целью исследования является:
· обеспечить воспроизводимое разделение основных известных белков, характерных для данной ткани;
· показать присутствие известных минорных белков;
· выявить и идентифицировать маркерные белки, характеризующих известные изменения в данной ткани.
Для достижения цели решают следующие задачи:
1) Все белки, содержащиеся в изучаемом образце, подвергаются солюбилизации и становятся объектами анализа;
2) Проводится аналитическое фракционирование по двум независимым друг от друга физико-химическим свойствам полипептидных цепей, отражающих особенности их первичной структуры - комбинированное использование – двумерный гель-электрофорез (2D):
· Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ), обеспечивает фракционирование по pI.
· Электрофорез в присутствии SDS (SDS-ЭФ) обеспечивает разделение по Mm.
3) Выявление белковых фракций после разделения с помощью высокочувствительных методов детекции белков (различные модификации масс-спектрометрии).
4) Стандартизированное описание белков на двумерных электрофореграммах в системе прямоугольных координат, в которых одна из координат являться функцией молекулярной массы, а другая – изоэлектрической точкой для каждого вида полипептидных цепей.
|
|
Рис.6. Схема протеомных исследований
Таблица 2.
Процесс | Критические параметры |
1. Сбор и приготовление образцов | · Солюбилизация, · подбор оптимальных условий |
2. I направление (IEF) | · Повышение разрешения – использование иммобилиновых стрипов |
3. II направление (SDS PAGE) | · Повышение разрешения – увеличение размера геля |
4. Детекция белков (окраска и/или авторадиография, иммунодетекция) | · Чувствительность, · избирательность детекции/окраски |
5. Создание коллекций 2D гелей | · Компьютерный анализ изображений |
6. Вырезание отдельных белковых пятен | · Точность попадания |
7. Идентификация белков | · Масс-спектрометрия · Интерпретация данных |
8. Формирование банка данных | · Сравнение с другими базами данных |
Создание протеома изучаемого объекта |
Заключение
Современная протеомика имеет почти 30-ти летнюю историю, началом которой стали разработки метода двумерного электрофореза белков и создание системного подхода в исследованиях белковых продуктов генной экспрессии. Протеомика располагает внушительным методическим арсеналом и большими ресурсами по биоинформатике. Это позволяет надеяться, что прогресс в протеомных исследованиях человека (в сочетании с прогрессом в других областях функциональной геномики) качественно усилит потенциал современной клинической биохимии.
Протеомика является важнейшим источником новых знаний о белках человека, которые необходимы для клинической биохимии, поскольку на основе этих знаний формируются и детализируются представления о молекулярных основах различных болезней, а также расширяются диагностические возможности современной медицины.
Литература:
6. Остерман исследования белков и нуклеиновых кислот. Москва, Наука, 2002.
7. Карягина . Клинико-диагностическая интерпретация электро-фореграмм белков сыворотки крови. Учебно-методическое пособие. - СПб. Изд-во СПбГУ, 2000.
8. N. G.Anderson, N. L.Anderson. Twenty years of two-dimensional electrophoresis: Past, present and future. Electrophoresis, (1996) 17, pp. 443-453.
9. Rob Haselberg ∗, Gerhardus J. de Jong, Govert W. Somsen. Capillary electrophoresis–mass spectrometry for the analysis of intact proteins. Journal of Chromatography, (20pp 81–109
10. Jurgen Cox and Matthias Mann. Is Proteomics the New Genomics? Cell 130, (2007) pp 395-398.
11. Wikipedia: http://en. wikipedia. org/
