- Для прибора iCycler iQ выбрать опцию Edit Protocol модуля Workshop. Задать параметры амплификации (количество циклов, время и температуру циклирования), а в окне справа указать шаг считывания флуоресцентного сигнала: Cycle 3 – Step 2. Сохранить протокол, задав имя файла в окне Protocol Filename (Chla-psit. tmo) и нажав кнопку Save this protocol (в верхней части экрана). При последующих постановках можно выбрать файл с этой программой в закладке View Protocol в модуле Library. Выбрав или отредактировав нужную программу, назначить ее использование, нажав кнопку Run with selected plate setup.
Поместить предварительно подготовленные для проведения ПЦР пробирки в модуль в соответствии с заданной схемой.
Запустить выполнение выбранной программы Chla-psit с заданной схемой планшета.
- Для прибора iCycler iQ5 перед запуском выполнения программы следует проверить правильность выбранного протокола (Selected Protocol) и схемы планшета (Selected Plate Setup). Для запуска нажать кнопку Run. Выбрать для измерения факторов лунок вариант Collect Well Factors from Experimental Plate. Нажать кнопку Begin Run, дать название эксперимента (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента) и нажать OK.
- Для прибора iCycler iQ перед запуском выполнения программы в окне Run Prep следует проверить правильность выбранного имени протокола и схемы планшета. Выбрать для измерения факторов лунок вариант Experimental Plate в меню Select well factor source. Задать объем реакционной смеси в окне Sample Volume – 25 мкл. Для запуска нажать кнопку Begin Run, дать название эксперимента (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента) и нажать OK.
После окончания программы приступить к анализу результатов.
В. Анализ результатов
- Запустить программу и открыть файл с результатами эксперимента. Для этого:
- Для прибора iCycler iQ5 выбрать нужный файл с данными анализа в окне Data File модуля Workshop и нажать кнопку Analyze.
- Для прибора iCycler iQ в модуле Library активировать окно View Post-Run Data. В окне Data Files выбрать нужный файл с данными анализа и нажать кнопку Analyze Data.
- Анализ результатов проводится по каналам FAM и JOE. Результаты обрабатывают для каждого канала по отдельности, активируя кнопку с названием соответствующего флуорофора.
- В режиме анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию) поочередно для каждого канала установить пороговую линию, двигая ее курсором при нажатой левой кнопке мыши, на уровне 10-20 % от максимального уровня флуоресценции на последних циклах амплификации. При этом пороговая линия должна пересекать только S-образные кривые накопления сигнала положительных образцов и контролей на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции, переходящего в линейный подъем и не пересекать базовую линию.
- Чтобы вывести на экран таблицу результатов, нажать кнопку PCR Quant (iCycler iQ) или кнопку Results (iCycler iQ5).
Дальнейший учет результатов проводят, используя полученные значения Ct.
Г. Учет результатов
Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов).
В образце обнаружена ДНК Chlamydophila psittaci, если для данной пробы значение Ct на канале JOE менее 37.
В образце не обнаружена ДНК Chlamydophila psittaci, если для данной пробы по каналу JOE значения Сt отсутствуют (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а по каналу FAM определено значение Ct, не превышающее 33.
Результат анализа сомнительный, если для данной пробы на канале JOE получено значение Ct больше 37, а значение Ct по каналу FAM не превышает 33. В этом случае требуется повторно провести ПЦР-исследование соответствующего образца, начиная с этапа экстракции ДНК. В случае повторения результата или получения значения Ct менее 40, считать, что ДНК Chlamydophila psittaci обнаружена.
Результат анализа невалидный, если для данной пробы не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct по каналу JOE, и по каналу для флуорофора FAM значение Сt также не определено (отсутствует) или превышает 33. В этом случае требуется повторно провести ПЦР-исследование соответствующего образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контрольных реакций (см. табл. 4).
Таблица 4. Оценка результатов анализа контролей
Контроли | Контролируемый этап ПЦР-анализа | Значение Сt по каналу | |
FAM | JOE | ||
ОК | Экстракция ДНК | < 33 | Нет значений |
К- | ПЦР | Нет значений | Нет значений |
K+ | ПЦР | < 30 | < 30 |
- Если для положительного контроля ПЦР (К+) значение порогового цикла Ct по каналу JOE отсутствует или превышает граничное значение, указанное в таблице 4, необходимо повторить амплификацию для всех образцов, в которых не обнаружена ДНК Chlamydophila psittaci.
- Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля экстракции ДНК на канале JOE и/или для отрицательного контроля ПЦР (К–) на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить ПЦР-исследование всех проб, начиная с этапа экстракции ДНК, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.
Лист вносимых изменений
Редакция | Место внесения изменений | Суть вносимых изменений |
26.03.08 | По всему тексту | Уточнены названия реагентов. |
Удален прибор «GeneAmp PCR System 2400», «Applied Biosystems». Добавлен прибор «GeneAmp PCR System 2700», «Applied Biosystems». | ||
п. Транспортирование и хранение | Уточнены условия хранения тест-системы. | |
п. Порядок проведения ПЦР | Уточнены материалы и оборудование, требуемые для работы. | |
28.04.08 | п. Общие положения | Изменен объем фасовки реагента ПКО ДНК Chlamydophila psittaci. |
23.08.08 | По всему тексту | Уточнены термины и сокращения. Комплект реагентов «АмплиСенс» заменен на «ПЦР-комплект». |
05.08.11 VV | Титульный лист | Внесена новая печать |
п. Общие положения | назначение тест-системы добавлено отдельным пунктом 1 | |
объем реагентов указан в см3 | ||
Изменен объем фасовки реагента ОКО на 1,2 см3 | ||
п. Транспортирование и хранение | Срок годности тест-системы изменен с 6 на 12 месяцев с даты изготовления | |
Принцип метода | раздел «Принцип проведения реакции» переименован в «Принцип метода» | |
Проведение ПЦР-анализа | «Порядок проведения ПЦР» переименован в «Проведение ПЦР-анализа» | |
Уточнен перечень и названия применяемого оборудования | ||
Таблица 1. Программа для амплификации ДНК Chlamydophila psittaci | Добавлена программа амплификации для прибора «Maxygene», изменена программа амплификации. | |
Меры личной профилактики | Добавлены меры личной профилактики | |
По тексту | Добавлено: «Рекомендовано к регистрации в Российской Федерации ФГУ «ВГНКИ» «С утверждением настоящей инструкции инструкция, утвержденная Россельхознадзором 19.09.2007 года, утрачивает силу» | |
Увеличено количество пунктов в связи с внесенными дополнениями | ||
25.01.13 VN | По тексту | «Выделение» заменено на «Экстракция» |
Отрицательный контроль экстракции заменен с «ОК» на «В–» | ||
Удален регистрационный номер и печати | ||
Изменено название института на ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора | ||
Общие положения | Добавлены формы комплектации 1 и 2 | |
Изменены единицы измерения объемов реагентов с см3 на см3 (мл) | ||
Нижний колонтитул | Изменены каталожные номера VET-2-R0,2-К; | |
26.04.13 ОМ | Нижний колонтитул | Формат и форма вынесены перед каталожным номером |
Редакция | Место внесения изменений | Суть вносимых изменений |
17.10.13 ME | По тексту | Инструкция приведена в соответствие с шаблоном |
Добавлен формат FRT | ||
Изменена нумерация разделов | ||
Добавлены приложения 1, 2 и 3 | ||
Добавлен раздел «Аналитические характеристики» | ||
ПКО ДНК Chlamydophila psittaci заменен на ПКО Chlamydophila psittaci | ||
ДНК-буфер (0,5 мл) заменен на К– (0,2 мл) | ||
В– заменено на ОК | ||
Нижний колонтитул | Добавлено «Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-2-FRT-K» |
[1] Количество геномных эквивалентов микроорганизма (ГЭ) в 1 мл образца биологического материала.
[2] При экстракции ДНК с помощью комплекта «ДНК-сорб B» необходимо избегать попадания сорбента универсального в реакционную смесь.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 |
