ИНСТРУКЦИЯ
по применению тест-системы «ХЛА-ПСИТ» для выявления возбудителя хламидиоза Chlamydophila psittaci методом полимеразной цепной реакции |
(организация-производитель - ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва) |
Тест-система «ХЛА-ПСИТ» (test-system «CHLA-PSIT») для выявления ДНК возбудителя хламидиоза Chlamydophila psittaci в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) выпускается в двух форматах:
Формат EPh – для выявления ДНК возбудителя хламидиоза Chlamydophila psittaci методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле.
Формат FRT – для выявления ДНК возбудителя хламидиоза Chlamydophila psittaci методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
I. Общие положения
1 Форматы и формы выпуска тест-системы.
Формат EPh
Тест-система «ХЛА-ПСИТ» (test-system «CHLA-PSIT») формат EPh, рассчитанная на проведение 50 анализов, включая контроли, выпускается в 2 формах комплектации:
Форма 1 включает:
- «ДНК-сорб-В» вариант 50 – комплект реагентов для выделения ДНК из клинического материала;
- «ПЦР-комплект» вариант 50 R – комплект реагентов для амплификации ДНК Chlamydophila psittaci;
- «ЭФ» вариант 200 – комплект реагентов для электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле.
Форма 2 включает:
- «ПЦР-комплект» вариант 50 R – комплект реагентов для амплификации ДНК Chlamydophila psittaci.
Форма комплектации 1 предназначена для проведения полного ПЦР-исследования, включающего экстракцию ДНК из биологического материала, амплификацию ДНК Chlamydophila psittaci и электрофоретическую детекцию.
Форма комплектации 2 предназначена для проведения амплификации ДНК Chlamydophila psittaci. Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо использовать комплекты реагентов для экстракции ДНК, электрофоретической детекции, рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.
Формат FRT
Тест-система «ХЛА-ПСИТ» (test-system «CHLA-PSIT») формат FRT, рассчитанная на проведение 50 анализов, включая контроли, выпускается в 2 формах комплектации:
Форма 1 включает:
- «РИБО-преп» вариант 50 – комплект реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала;
- «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F – комплект реагентов для амплификации ДНК Chlamydophila psittaci с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
Форма 2 включает:
- «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F – комплект реагентов для амплификации ДНК Chlamydophila psittaci с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
Форма комплектации 1 предназначена для проведения полного ПЦР-исследования, включающего экстракцию ДНК из биологического материала, амплификацию ДНК Chlamydophila psittaci с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
Форма комплектации 2 предназначена для проведения амплификации ДНК Chlamydophila psittaci с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо использовать комплекты реагентов для экстракции ДНК, рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.
1.1 Комплект реагентов «ДНК-сорб-В» вариант 50 состоит из следующих компонентов:
Лизирующий раствор Раствор для отмывки 1 Раствор для отмывки 2 Сорбент универсальный ТЕ-буфер для элюции ДНК | 1 флакон, 15,0 см3 (мл) 1 флакон, 15,0 см3 (мл) 1 флакон, 50,0 см3 (мл) 1 пробирка, 1,25 см3 (мл) 1 пробирка, 5,0 см3 (мл) |
Комплект реагентов рассчитан на экстракцию ДНК из 50 проб, включая контроли.
1.2 Комплект реагентов «РИБО-преп» вариант 50 состоит из следующих компонентов:
Раствор для лизиса Раствор для преципитации Раствор для отмывки 3 Раствор для отмывки 4 РНК-буфер | 1 флакон, 15,0 см3 (мл) 1 флакон, 20,0 см3 (мл) 1 флакон, 25,0 см3(мл) 1 флакон, 10,0 см3(мл) 4 пробирки по 1,2 см3 (мл) |
Комплект реагентов рассчитан на экстракцию РНК/ДНК из 50 проб, включая контроли.
1.3 Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант 50 R состоит из следующих компонентов:
ПЦР-смесь-1-R ХЛА-ПСИТ, раскапана под воскв пробирки объемом 0,5 или 0,2 см3 (мл) ПЦР-смесь-2 blue Минеральное масло для ПЦР К– | 55 пробирок по 0,005 см3(мл) 1 пробирка, 0,6 см3 (мл) 1 пробирка, 2,0 см3 (мл) 1 пробирка, 0,2 см3 (мл) |
Комплект реагентов рассчитан на 55 реакций амплификации, включая контроли.
К комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа экстракции:
ПКО Chlamydophila psittaci | 1 пробирка, 0,1 см3(мл) |
ОКО | 1 пробирка, 1,2 см3 (мл) |
1.4 Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F состоит из следующих компонентов:
ПЦР-смесь-FL ХЛА-ПСИТ ПЦР-буфер-С Полимераза (TaqF) К+ Chlamydophila psittaci / STI К– | 1 пробирка, 0,6 см3 (мл) 1 пробирка, 0,3 см3 (мл) 1 пробирка, 0,03 см3 (мл) 1 пробирка, 0,2 см3 (мл) 1 пробирка, 0,2 см3 (мл) |
Комплект реагентов рассчитан на 55 реакций амплификации, включая контроли.
К комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа экстракции:
ВКО-FL ОКО | 1 пробирка, 1,0 см3 (мл) 1 пробирка, 1,2 см3 (мл) |
1.5 Комплект реагентов «ЭФ» вариант 200 состоит из следующих компонентов:
Трис-боратный буфер (ТБЕ) концентрированный с бромидом этидия Агароза для электрофореза ДНК | 1 флакон, 50,0 см3 (мл) 2 флакона по 1,7 г |
Комплект реагентов рассчитан на электрофоретический анализ 240 образцов (из расчета 100 мл геля – 5 рядов по 24 лунки).
2 Упаковка и маркировка.
На пробирках (флаконах) с каждым компонентом должна быть наклеена этикетка с указанием краткого наименования компонента, количества препарата в пробирке (флаконе), номера серии и даты изготовления. Комплекты реагентов упаковывают в отдельные застегивающиеся пакеты из полиэтилена. На каждый пакет наклеивают (или вкладывают) этикетку с указанием наименования комплекта, перечня компонентов, входящих в комплект, количества пробирок (флаконов) каждого компонента, количества препарата в каждой пробирке (флаконе), номера серии комплекта, условий хранения, даты изготовления, срока годности.
Комплекты реагентов вкладывают в картонную коробку (пакет из полиэтилена). На каждую упаковку тест-системы наклеивают (или вкладывают) этикетку, на которой указывают: наименование предприятия-изготовителя, полное наименование тест-системы, перечень комплектов, входящих в тест-систему, номер серии, дату изготовления, срок годности, условия хранения, обозначения настоящих ТУ/СТО, надпись «Для животных». В каждую упаковку вкладывают инструкцию по применению тест-системы.
3 Транспортирование и хранение.
Тест-систему транспортировать при температуре от 2 °С до 8 °С не более 5 суток. При получении разукомплектовать в соответствии с указанными температурами хранения. Комплект реагентов «ДНК-сорб-В», «РИБО-преп» хранить при температуре от 2 °С до 25 °С.
Формат EPh. Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант 50 R хранить при температуре от 2 °С до 8 °С, комплект реагентов «ЭФ» хранить при температуре от 18 °С до 25 °С в защищенном от света месте.
Формат FRT. Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F (кроме ПЦР-смеcи-FL ХЛА-ПСИТ, ПЦР-буфера-С и полимеразы (TaqF)) хранить при температуре от 2 °С до 8 °С. ПЦР-смеcь-FL ХЛА-ПСИТ, ПЦР-буфер-С и полимеразу (TaqF) хранить при температуре от минус 24 °С до минус 16 °С. ПЦР-смеcь-FL ХЛА-ПСИТ хранить в защищенном от света месте.
4 Срок годности тест-системы – 12 месяцев с даты изготовления.
II. ПРИНЦИП МЕТОДА
5 Формат EPh. Метод обнаружения ДНК Chlamydophila psittaci основан на экстракции ДНК из биологического материала, проведении амплификации полученной ДНК и электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле.
Формат FRT. Метод обнаружения ДНК Chlamydophila psittaci основан на экстракции ДНК из биологического материала совместно с ДНК экзогенного неконкурентного внутреннего контрольного образца (ВКО), проведении амплификации полученной ДНК и гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов амплификации в режиме «реального времени». Результат амплификации ДНК Chlamydophila psittaci регистрируется на канале JOE/Yellow, результат амплификации экзогенного ВКО регистрируется на канале флуоресценции FAM/Green. Использование экзогенного ВКО позволяет контролировать основные этапы ПЦР-анализа (экстракцию ДНК и проведение амплификации ДНК).
III. Аналитические характеристики
Аналитическая чувствительность
Вид биологического материала | Комплект для экстракции ДНК | Комплект для амплификации и детекции | Аналитическая чувствитель-ность, ГЭ/мл[1] |
мазки со слизистых, суспензии органов и тканей, суспензии помета | «ДНК-сорб-В» | «ПЦР-комплект» вариант 50R | 5х103 |
мазки со слизистых, суспензии органов и тканей, суспензии помета | «РИБО-преп» | «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F | 1х103 |
Аналитическая специфичность
Отсутствуют неспецифические реакции при тестировании образцов следующих микроорганизмов: вирус инфекционного бронхита кур, вирус болезни Ньюкасла, вирус гриппа А, Brucella suis; Brucella abortus; Brucella ovis; Brucella canis; Brucella melitensis; Haemophilus parasuis; Actinobacillus pleuropneumoniae; Bordetella bronchiseptica; Pasterella multocida; Leptospira interrogans; Listeria monocytogenes; Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium; Mycobacterium paratuberculosis; Mycoplasma hyopneumoniae; Mycoplasma hyorhinis; Mycoplasma hyosynovia; Mycoplasma mycoides;, Mycoplasma meleagridis; Mycoplasma gallisepticum; Mycoplasma sinovia; Escherichia coli; Campylobacter jejuni; Campylobacter fetus; Clostridium perfringens; Klebsiella pneumoniae; Lawsonia intracellularis; Pseudomonas aeruginosa; Salmonella choleraesuis; Salmonella dublin; Shigella flexneri; Staphylococcus aureus; Streptococcus suis; Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis.
При проведении тестирования данной панели штаммов, а также образцов ДНК человека, свиньи, КРС, собаки, кошки, овцы, разных видов птиц неспецифических реакций выявлено не было.
IV. ПОРЯДОК ОТБОРА И ПОДГОТОВКИ ПРОБ
6 Тест-система «ХЛА-ПСИТ» предназначена для выявления ДНК Chlamydophila psittaci в биологическом материале от птиц методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
7 Взятие, транспортирование и хранение материала для исследования.
7.1 При отборе образцов материала, а также при подготовке проб для исследования необходимо соблюдать меры, предупреждающие обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями.
7.2 Материал от каждого животного берут отдельными инструментами.
7.3 Взятие материала для исследования:
- мазки со слизистых оболочек (конъюнктивы, ротоглотки, клоаки) берут сухими стерильными зондами с ватными тампонами. После взятия материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с 500 мкл стерильного физиологического раствора или фосфатного буфера. Конец зонда отламывают, с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.
- помет птиц берут в стерильные контейнеры в количестве 1–3 г. В связи с непостоянным выделением возбудителя у инфицированной птицы, рекомендуется исследовать не менее трех образцов от одной и той же особи, взятых в течение 4–5 сут.
- фрагменты тканей и органов (легкие, селезенка, печень и др.) помещают в стерильный контейнер.
7.4 Материалы доставляют в лабораторию в течение суток, сохраняя при температуре от 2 °С до 8 °С. Допускается хранение материала при температуре от минус 24 °С до минус 16 °С в течение 7 суток, при температуре не выше минус 68 °С – в течение длительного времени. Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.
8 Подготовка исследуемого материала.
8.1 Из помета птиц готовят 10 % суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензии помета и мазки с клоаки центрифугируют при 150 g (1,5 тыс. об/мин на центрифуге MiniSpin, Eppendorf, Германия) в течение 5 мин. Экстракцию ДНК проводят из 100 мкл надосадочной жидкости.
8.2 Мазки со слизистых конъюнктивы и ротоглотки исследуют без предварительной подготовки.
8.3 Пробы тканей и органов гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков или автоматического гомогенизатора, затем готовят 10 % суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензию отстаивают при комнатной температуре в течение 2–3 мин и 50 мкл верхней фазы суспензии используют для экстракции ДНК.
V. ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-АНАЛИЗА
9 Формат EPh: ПЦР-анализ проводят в три этапа в отдельных помещениях (зонах).
Формат FRT: ПЦР-анализ проводят в два этапа в отдельных помещениях (зонах).
Для работы требуются следующие материалы и оборудование.
9.1 ЗОНА 1 – для экстракции ДНК из исследуемого материала:
- стерильный ламинарный шкаф (например, «БАВп-01-«Ламинар-С»-1,2», «Ламинарные системы», Россия).
- твердотельный термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 °С до 100 °С (например, «ТЕРМО 24-15», «Биоком», Россия).
- вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости (например, «ОМ-1», Россия).
- микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс g (например, «MiniSpin», «Eppendorf», Германия).
- центрифуга/вортекс для пробирок типа «Эппендорф» (например «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).
- отдельный набор электронных или механических дозаторов переменного объема (например, «Ленпипет», Россия).
- одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до 100 мкл, до 200 мкл и до 1000 мкл (например, Axygen, США).
- одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл (например, Axygen, США).
- одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся пробирки на 1,5 мл (например, Axygen, США).
- штативы для пробирок объемом 1,5 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия) и наконечников (например, Axygen, США).
- холодильник от 2 °С до 8 °С с морозильной камерой от минус 24 °С до минус 16 °С.
- отдельный халат и одноразовые перчатки.
- емкость для сброса наконечников.
- комплект средств для обработки рабочего места.
9.2 ЗОНА 2 – для проведения амплификации ДНК:
- Формат EPh: амплификатор (например, «Терцик», «ДНК-Технология», Россия, или эквивалентный.
- Формат FRT: амплификатор (например, Rotor-Gene 3000/6000, Corbett Research, Австралия; Rotor-Gene Q, QIAGEN, Германия, или iCycler iQ или iQ5, Bio-Rad, США)
- ПЦР-бокс (например, «БАВ-ПЦР-«Ламинар-С», «Ламинарные системы», Россия).
- центрифуга/вортекс (например «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).
- набор электронных или механических дозаторов переменного объема (например, «Ленпипет», Россия).
- одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до 100 мкл, до 200 мкл и до 1000 мкл (например, Axygen, США).
- Формат FRT: одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл (например, Axygen, США).
- штативы для наконечников (например, Axygen, США) и пробирок объемом 0,5 (0,2) мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия).
- холодильник от 2 °С до 8 °С с морозильной камерой от минус 24 °С до минус 16 °С
- отдельный халат и одноразовые перчатки.
- емкость для сброса наконечников.
- комплект средств для обработки рабочего места.
9.3 Формат EPh: ЗОНА 3 – для детекции продуктов амплификации методом электрофореза в агарозном геле:
- камера для горизонтального электрофореза объемом не более 400 мл (например, SE-2, «Хеликон», Россия).
- источник постоянного тока с напряжением 150 – 460 В (например, «Эльф-4», «ДНК-Технология», Россия).
- ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом для просмотра гелей (например, «Биоком», Россия).
- видеосистема с цифровой видеокамерой для регистрации результатов (например, «Биотест-1», ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия; BioRad, США).
- аквадистиллятор.
- холодильник от 2 °С до 8 °С.
- микроволновая печь для плавления агарозы.
- колба коническая из термостойкого стекла (ГОСТ ) для плавления агарозы на 250 мл.
- мерный цилиндр на 1 л (ГОСТ 1770-74).
- штатив для пробирок на 0,5 (0,2) мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия).
- отдельный механический или электронный дозатор переменного объема 10–40 мкл (например, «Ленпипет», Россия).
- одноразовые наконечники до 200 мкл в штативе (например, Axygen, США).
- пластиковая емкость на 5 л для дезактивации буфера и гелей, содержащих бромид этидия.
- отдельный халат и одноразовые перчатки.
10 Порядок работы
10.1 ЭТАП 1 (зона 1). Экстракция ДНК из исследуемого материала
Экстракция ДНК при помощи комплекта реагентов «ДНК-сорб-В» для формата EPh:
Лизирующий раствор и раствор для отмывки 1 (если они хранились при температуре от 2 до 8 °С) прогреть при температуре 60–65 °С до полного растворения кристаллов.
Подготовить необходимое количество одноразовых пробирок (включая отрицательный и положительный контроли экстракции). Внести в каждую пробирку по 300 мкл лизирующего раствора. Промаркировать пробирки. В пробирки с лизирующим раствором внести по 100 мкл пробы, используя наконечники с фильтром. В пробирку отрицательного контроля экстракции (ОК) внести 100 мкл ОКО. В пробирку положительного контроля экстракции (ПК) внести 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО Chlamydophila psittaci.
Пробы тщательно перемешать на вортексе и прогреть 5 мин при температуре 65 °С в термостате. Процентрифугировать 5 с при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге. Если проба растворилась не полностью, процентрифугировать пробирку на микроцентрифуге 5 мин при максимальных оборотах и использовать для экстракции ДНК надосадочную жидкость, перенеся ее в новую пробирку.
Тщательно ресуспендировать сорбент универсальный на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента универсального. Перемешать на вортексе, поставить в штатив на 2 мин, еще раз перемешать и оставить в штативе на 5 мин.
Осадить сорбент универсальный в пробирках центрифугированием при 5 тыс об/мин в течение 30 с. Аккуратно отобрать надосадочную жидкость, не задевая осадок, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.
Добавить в пробы по 300 мкл раствора для отмывки 1. Перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального. Осадить сорбент универсальный центрифугированием при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге в течение 30 с. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.
Добавить в пробы по 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального, процентрифугировать 30 с при 10 тыс. об/мин на микроцентрифуге. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.
Повторить процедуру отмывки раствором для отмывки 2, удалить надосадочную жидкость полностью.
Поместить пробирки в термостат при температуре 65 °С на 5–10 мин для подсушивания сорбента универсального (при этом крышки пробирок должны быть открыты).
В пробирки добавить по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат при температуре 65 °С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.
Процентрифугировать пробирки на максимальных оборотах микроцентрифуги в течение 1 мин. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.
Очищенную ДНК можно хранить до 4 ч при температуре от 2 °С до 8 °С или длительно при температуре от минус 24 °С до минус 16 °С.
Экстракция ДНК при помощи комплекта реагентов «РИБО-преп» для формата FRT:
Раствор для лизиса (если он хранился при температуре от 2 °С до 8 °С) прогреть при температуре 65 °С в термостате до полного растворения кристаллов.
Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок на 1,5 мл с плотно закрывающимися крышками (включая отрицательный контроль экстракции).
Внести в каждую пробирку по 300 мкл раствора для лизиса и по 10 мкл ВКО-Fl (для варианта FRT). Промаркировать пробирки.
В пробирки с раствором для лизиса и ВКО-FL внести по 50–100 мкл исследуемых проб, используя наконечники с фильтрами. В пробирку отрицательного контроля (ОК) экстракции внести 100 мкл ОКО.
Содержимое пробирок тщательно перемешать на вортексе и прогреть 5 мин при 65 °С в термостате.
Добавить в пробирки по 400 мкл раствора для преципитации, перемешать на вортексе.
Процентрифугировать пробирки на микроцентрифуге в течение 5 мин при 13 тыс об/мин.
Аккуратно отобрать надосадочную жидкость, не задевая осадок, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник на 200 мкл для каждой пробы.
Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3, плотно закрыть крышки, осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3–5 раз. Можно провести процедуру одновременно для всех пробирок, для этого необходимо накрыть пробирки в штативе сверху крышкой или другим штативом, прижать их и переворачивать штатив.
Процентрифугировать при 13 тыс об/мин в течение 1–2 мин на микроцентрифуге.
Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник на 10 мкл для каждой пробы.
Добавить в пробирки по 200 мкл раствора для отмывки 4, плотно закрыть крышки и осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз.
Процентрифугировать при 13 тыс об/мин в течение 1–2 мин на микроцентрифуге.
Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник на 10 мкл для каждой пробы.
Поместить пробирки в термостат при температуре 65 °С на 5 мин для подсушивания осадка (при этом крышки пробирок должны быть открыты).
Добавить в пробирки по 50 мкл РНК-буфера. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат при температуре 65 °С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.
Процентрифугировать пробирки при 13 тыс об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.
Очищенную ДНК можно хранить до 4 ч при температуре от 2 °С до 8 °С или длительно при температуре от минус 24 °С до минус 16 °С.
10.2 ЭТАП 2 (зона 2). Проведение амплификации участка ДНК.
Проведение амплификации с использованием комплекта реагентов «ПЦР-комплект» вариант 50 R и электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле с использованием комплекта реагентов «ЭФ» вариант 200 см. приложение 1.
Проведение амплификации с использованием комплекта реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F см. приложения 2, 3.
VI. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
11 Работа должна проводиться согласно правилам МСХиП РФ 27.01.1997 г. № 13-7-2/840 «Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения», утвержденным Департаментом ветеринарии.
12 Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в отдельных помещениях (зонах). Работу следует начинать в Зоне Экстракции, продолжать в Зоне Амплификации и Детекции. Не возвращать образцы и реактивы в зону, в которой была проведена предыдущая стадия процесса. Все лабораторное оборудование, в том числе дозаторы, штативы, лабораторная посуда, а также все рабочие растворы должны быть строго стационарными. Запрещается переносить их из одного помещения в другое. Запрещается перемещение персонала из помещения для электрофореза в другие рабочие помещения лаборатории.
13 Использовать одноразовые перчатки, лабораторные халаты, защищать глаза во время работы с образцами и реактивами.
14 Использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для автоматических дозаторов с фильтром.
15 Одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники) необходимо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующее средство, которое может быть использовано для обеззараживания биоматериалов (например, 0,2 % раствор натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты).
16 Посуда (ступки и пестики) и металлические инструменты (скальпели, ножницы, пинцеты), использованные для гомогенизации, выдерживаются в растворе дезинфицирующего средства (например, 0,2 % раствор натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты) в течение одного часа или в растворе хромовой смеси в течение 30 минут, моются водопроводной водой с поверхностно-активными моющими средствами и после отмывания в проточной и деионизованной воде высушиваются в сухожаровом шкафу в течение 4 часов при температуре 180 °С.
17 Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка ПЦР, до начала и после завершения работ необходимо подвергать ультрафиолетовому облучению в течение 30 мин.
П. п. 18 выполняется только для варианта EPh
18 При работе с включенным трансиллюминатором необходимо пользоваться защитным экраном или защитной маской.
19 Тест-систему хранить в местах, не доступных для детей.
Инструкция разработана ФГБУ «ВГНКИ» (г. Москва), совместно с ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора ( а).
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
Формат EPh
Проведение амплификации, ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
I. ЭТАП 2 (зона № 2). Проведение амплификации.
В комплекте реагентов для амплификации «ПЦР-комплект» применяется «горячий старт», который обеспечивается разделением нуклеотидов и Taq-полимеразы прослойкой воска. Плавление воска и перемешивание реакционных компонентов происходит только при 95 °С, что значительно снижает количество неспецифически затравленных реакций.
Общий объем реакции – 25 мкл, объем пробы ДНК – 10 мкл.
Порядок работы:
А. Подготовка пробирок для амплификации
Подготовить необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-R ХЛА-ПСИТ для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб.
На поверхность воска внести по 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-R ХЛА-ПСИТ.
Сверху добавить по капле минерального масла для ПЦР (примерно 25 мкл). При использовании амплификатора с термостатируемой крышкой минеральное масло можно не добавлять.
В подготовленные пробирки под масло или непосредственно на масло, используя наконечники с фильтром, внести по 10 мкл ДНК исследуемых образцов или контролей этапа экстракции.
Поставить контрольные реакции амплификации:
а) отрицательный контроль ПЦР (К–) – внести в пробирку 10 мкл реагента К–.
б) положительный контроль ПЦР (К+) – внести в пробирку 10 мкл ПКО Chlamydophila psittaci.
Б. Проведение амплификации
Запустить на амплификаторе программу (см. табл. 1). Когда температура в ячейке амплификатора достигнет 95 °С, поставить программу на паузу, поместить пробирки в ячейки амплификатора, закрыть крышку прибора и снять программу с паузы.
Рекомендуется перед постановкой в амплификатор осадить капли со стенок пробирок кратким центрифугированием на вортексе (1–3 с).
Таблица 1. Программа для амплификации ДНК Chlamydophila psittaci
Амплификаторы с активным регулированием (по раствору в пробирке): | Амплификаторы с матричным регулированием температуры: «Ампли-3» («Биоком»); Biometra; MiniCycler, PTC-100 (MJ Research) | |||||||||||
Omn-E (Hybaid); «Терцик» («ДНК-Технология») | GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems); Palm-Cycler (Corbett Research) | MaxyGene (Axygen) | ||||||||||
цикл | темпе-ратура | время | циклы | темпе-ратура | время | циклы | темпе-ратура | время | циклы | темпе-ратура | время | циклы |
0 | 95°С | пауза | 95 °С | пауза | 95 °С | пауза | 95°С | пауза | ||||
1 | 95°С | 5 мин | 1 | 95 °С | 5 мин | 1 | 95 °С | 5 мин | 1 | 95°С | 5 мин | 1 |
2 | 95°С | 10 с | 41 | 95 °С | 10 с | 41 | 95 °С | 30 с | 42 | 95°С | 1 мин | 41 |
61°С | 10 с | 61 °С | 25 с | 61 °С | 45 с | 61°С | 1 мин | |||||
72°С | 10 с | 72 °С | 25 с | 72 °С | 45 с | 72°С | 1 мин | |||||
3 | 72°С | 1 мин | 1 | 72 °С | 1 мин | 1 | 72 °С | 1 мин | 1 | 72°С | 1 мин | 1 |
4 | 10°С | хранение | 4 °С | хранение | 10 °С | хранение | 10°С | хранение |
После окончания реакции пробирки отправить в помещение для детекции продуктов ПЦР (зону 3).
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 |
