Сравнение антигипоксической и мнестической активности ряда ноотропов и адаптогенов (экспериментальное исследование) (стр. 1 )

На правах рукописи

СТАСЮК ОЛЬГА НИКОЛАЕВНА

СРАВНЕНИЕ АНТИГИПОКСИЧЕСКОЙ И МНЕСТИЧЕСКОЙ

АКТИВНОСТИ РЯДА НООТРОПОВ И АДАПТОГЕНОВ

(экспериментальное исследование)

14.03.06 –фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Владивосток-2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Забайкальский Государственный университет» и на кафедре фармакологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Читинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, доцент

Официальные оппоненты:

д. м.н., профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации профессор кафедры фармакологии и клинической фармакологии

д. м.н., Институт биологии моря им.  Дальневосточного отделения РАН ведущий научный сотрудник лаборатории фармакологии

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение Научно-исследовательский институт фармакологии им. РАМН

Защита состоится « 20 » марта 2013г. на заседании диссертационного совета Д 208.007.03 при Тихоокеанском государственном медицинском университете Приморский край г. Владивосток, проспект Острякова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ Приморский край г. Владивосток, проспект Острякова, 2

Автореферат разослан « 23 » января 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Состояние гипоксической гипоксии возникает при различной патологии мозга, дыхательной и сердечно-сосудистой систем и других экстремальных состояниях. Как известно, гипоксическое воздействие быстро снижает парциальное напряжение кислорода крови и нарушает способность мозга утилизировать кислород, что вызывает каскад патологических метаболических реакций, прежде всего, в центральной нервной системе. Функциональные и метаболические изменения деятельности нейронов мозга проявляются ограничением клеточного дыхания при дефиците кислорода и угнетением его потребления, сдвигами активности ферментов энергетического и липидного обменов, нарушениями клеточного и ионного гомеостаза, и изменением биоэлектрической активности нейронов (, 1997; Луговая Е. М., 1997; , 2001; , 2004).

Гипоксия нервной ткани сопровождается развитием вторичных повреждений мозга (ВПМ), что признано основной причиной тяжести течения травм и инсультов мозга, цереброваскулярных расстройств и патологии, связанной с нахождением человека в замкнутом пространстве (Bramlett H. M., 2006; и др., 2006; , 2009). По статистическим данным у 40-65% больных отмечаются неблагоприятные исходы фармакотерапии острых поражений мозга: деменция¸ бессонница, апатия, депрессия, тревога и другие расстройства, сочетающиеся с периодами вторичного ухудшения неврологического статуса (Качков И. А. и др., 1999; , 2007; , 2010).

Для профилактики и терапии гипоксических состояний при различной патологии используют антигипоксанты и ноотропы синтетического происхождения. Вместе с тем, ноотропные средства (пирацетам, анирацетам, оксирацетам, меклофеноксат, пантогам и др.) оказывают терапевтическое действие, в основном, при патологии мозга, которая сопровождается умеренными нарушениями обучения, памяти и навыков у пациентов (, 2003; , 2006; , , 2006; , , 2008; , 2009). Антигипоксанты (бемитил, натрия оксибутират и др.) также недостаточно эффективны при постгипоксических состояниях, характерных при травме и инсульте мозга, преходящих нарушениях церебрального кровообращения. Они редко способствуют восстановлению высших интегративных функций мозга, но имеют различные побочные эффекты (, 2001; , И, 2001; и др., 2008). Эти наблюдения делают актуальным поиск новых препаратов с антигипоксической и мнестической активностью.

В настоящее время интерес исследователей направлен на изучение нейропротекторной и мнестической активности фитосредств, которые обладают психотонизирующим и адаптогенным эффектами. У ряда растительных препаратов установлено нормализующее влияние на энергетический и липидный обмены, позитивное действие на восстановление познавательных процессов при травмах, инсультах, расстройствах церебрального кровообращения. Среди них выделяются препараты родиолы розовой, женьшеня, элеутерококка и др. растений (, , 2005; , 1998). Вместе с тем, недостаточно данных об эффективности их применения с профилактической или терапевтической целью для восстановления высших интегративных функций мозга при острых гипоксических и постгипоксических состояниях, сопутствующих заболеваниям, одним из звеньев патогенеза которых является гипоксия нервной ткани. Изложенные факты указывают на актуальность сравнительной оценки антигипоксической и мнестической активности ноотропов и адаптогенов.

Цель работы: поиск эффективных средств фармакологической коррекции острых гипоксических и постгипоксических состояний, протекающих с нарушениями обучения и памяти.

Задачи исследования:

1.  Определить спектр мнестических и неврологических нарушений в условиях острой нормобарической гипоксии у грызунов (крысы, мыши);

2.  Изучить влияние веществ с ноотропным типом действия производные оксиникотиноиловой кислоты: оксиникотиноил ГАМК (ОНК-7) и оксиникотиноилглутаминовая кислота (ОНК-10) на выработку простых и сложных поведенческих реакций у интактных животных и в условиях острой нормобарической гипоксии;

3.  Оценить действие адаптогенов (экстракт солодки, женьшеня и родиолы розовой) на выработку простых и сложных поведенческих реакций у интактных животных и в условиях острой нормобарической гипоксии;

4.  Определить антигипоксическую активность ряда ноотропов и адаптогенов.

Научная новизна. В экспериментальных исследованиях использован комплекс методик, позволяющий определять спектр и эффективность действия ноотропов и адаптогенов при гипоксических расстройствах поведенческих реакций. У животных установлено угнетающее влияние острой гипоксии на процессы последовательного чередования и переноса опыта на новое научение, стадию становления простых и сложных поведенческих реакций.

Установлено, что эффективность новых веществ ноотропного типа действия в условиях гипоксии зависит от соотношения мнестического и противогипоксического эффектов в спектре фармакологической активности препарата. ОНК-10 проявляет выраженное мнестическое действие, облегчая выработку простых и сложных поведенческих реакций у интактных животных до и после острой гипоксии. Препарат нормализует процессы становления, последовательного чередования и переделок зрительных и пространственных дифференцировок. ОНК-10 оказывает выраженное антигипоксическое действие при острой нормобарической гипоксии с гиперкапнией.

Экстракт солодки и экстракт женьшеня обладают мнестической и антигипоксической активностью. Экстракт солодки облегчает выработку простых и сложных адаптивных поведенческих реакций у интактных животных и у животных после воздействия острой нормобарической гипоксии. Экстракт женьшеня активирует выработку простых поведенческих реакций и сложную реакцию последовательного чередования у животных в условиях гипоксического воздействия.

Практическая значимость исследования. Новые данные о мнестической и антигипоксической активности экстракта солодки и ОНК-10 вошли в материал учебного пособия «Нейротропные средства» и в материалы лекций и практических занятий для студентов специальностей психологического профиля по курсу «Нейрофармакология». Материалы диссертационного исследования используются в учебном процессе для проведения лекционных и практических занятий на кафедре фармакологии Читинской государственной медицинской академии; на кафедре техника, технология и безопасность жизнедеятельности, кафедре психологии и медико-биологических основ физической культуры Забайкальского государственного гуманитарно-педагогического университета, ныне Забайкальский государственный университет; на кафедре безопасности жизнедеятельности и инженерной защиты окружающей среды Иркутского государственного университета путей сообщения.

Для доклинического изучения веществ ноотропного типа действия рекомендована модель гипоксических расстройств выработки поведенческих реакций, позволяющая оценить влияние препаратов на когнитивные функции. Дано экспериментальное обоснование планирования дальнейших клинических исследований по применению экстракта солодки для профилактики мнестических и гипоксических нарушений в острой и промежуточной стадии травматической болезни мозга.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Спектр и эффективность препаратов с ноотропным типом действия зависит от их введения до или после воздействия острой гипоксии.

2. Экстракт солодки и ОНК-10 обладают ноотропным действием. Препараты облегчают выработку поведенческих реакций у интактных животных и при введении до и после воздействия острой гипоксии. Экстракт женьшеня эффективен у животных, подвергнутых острой нормобарической гипоксии. Экстракт родиолы розовой – при профилактическом применении до гипоксического воздействия.

3. Антигипоксическое действие ОНК-10, ОНК-7, экстрактов родиолы розовой, солодки и женьшеня сопоставимо с эффектом антигипоксанта натрия оксибутирата.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на 1-й Всероссийской научно-практической конференции «Медико-биологические аспекты системы образования» (2001); Всероссийской научной конференции «Физическая культура, экология и здоровье подрастающего поколения» (2003); Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы развития и воспитания в системе образования в начале нового тысячелетия» (2004); Научно-практической конференции «Безопасность в современном мире: теория и практика» (2006); Международной конференции «Травматология, ортопедия и восстановительная медицина», КНР (г. Маньчжурия, 2011); Второй научной конференции «Молодежь и наука Забайкалья» (Чита, 2011); Третьей Всероссийской научно-практической конференции «Физическая культура и спорт в условиях глобализации образования» (Чита, 2011) и на заседаниях кафедры медико-биологических основ физической культуры Забайкальского Государственного гуманитарно-педагогического университета и кафедры фармакологии Читинской Государственной медицинской академии (Чита, 2011, 2012); ХIХ Российском национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (2012, Москва); Международной научно - практической конференции «Адаптацiйнi можливостi дiтей та молодi» (Одесса, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, из них 3 в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад соискателя заключается в непосредственном участии в выполнении всех экспериментов и статистической обработке результатов экспериментов.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав с изложением результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка использованной литературы. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста, иллюстрирована 28 рисунками и 19 таблицами. Указатель литературы включает 179 из них 106 отечественных и 73 зарубежных источников.

Работа выполнена в рамках плановой темы НИР ЗАБГГПУ (№ госрегистрации ) и при поддержке Государственного гранта по вузу Минобрнауки РФ №на кафедре фармакологии Читинской Государственной медицинской академии.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы исследования. Эксперименты выполнены на 120 белых, не инбредных мышах, массой 18-22 г и 730 белых, беспородных крысах, массой 100-140 г, содержашихся в стандартных условиях вивария в соответствии с «Правилами лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ» (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96) и Приказом МЗ РФ № 000 от 01.01.2001. При проведении экспериментов учитывались требования Комиссии по проблеме этики отношения к животным Российского национального комитета по биоэтике при Российской академии наук и этические нормы, изложенные в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985). Исследования на животных одобрены локальным этическим комитетом при ФГБОУ ВПО Забайкальский государственный университет, запланирована в ФГБОУ ВПО Забайкальском государственном гуманитарно - педагогическом университете им. (протокол от 01.01.2001 года).

Методика оценки антигипоксической активности препаратов. Эффективность действия препаратов определяли по изменению продолжительности резервного времени у крыс или мышей в условиях нормобарической гермокамеры. При помещении животных в гермокамеру моделировали острую нормобарическую гипоксию с гиперкапнией, т. е. создавали модель воздействия двух факторов (нарастающие дефицит кислорода и гиперкапнию), повреждающих мозг при острых поражениях мозга ( и др.,1999; и (1976) в модификации , (1995, 1997) для крыс; , (2005, для мышей). Объем гермокамеры составлял 1000 мл для крыс и 200 мл для мышей. Показатель резервного времени жизни оценивали по продолжительности дыхания и сердечной деятельности у животных, помещенных в экспериментальную гермокамеру.

Методика оценки мнестических расстройств и эффектов препаратов. Гипоксическое повреждение процессов обучения простым и сложным поведенческим реакциям вызывали помещением животных в гермокамеру на 40 минут. Эксперименты с выработкой условной реакции активного избегания (УРАИ) на звуковой сигнал проводили у крыс, используя камеру с 3 отсеками: стартовым, промежуточным и безопасным. Условную реакцию зрительной дифференцировки (УРЗД) и переделки зрительных дифференцировок вырабатывали в Ý - образном лабиринте с электроболевым подкреплением (УРЗДп). Обучение реакции пространственной дифференцировки (РПД) и переделки пространственных дифференцировок (РПДп) выполняли
в 16-дверцевом лабиринте (,1987). Выработку реакции последовательного чередования (РПЧ) проводили в 6-дверцевом лабиринте, обучая животных последовательно чередовать дверцы лабиринта для избегания (, 1997).

Влияние препаратов на выработку и запоминание поведенческих адаптивных реакций оценивали по динамике показателей времени обучения, количества поисковых движений в первые 3 пробы и числа проб, затраченных на становление (критерий – 2-е первые условные реакции) и упрочение адаптивных ответов до критерия обучения (выполнение 5 правильных реакций подряд). Состояние безусловных рефлексов оценивали у животных по нескольким тестам: реакции сгибания; рефлекса переворачивания; роговичного рефлекса, постановки лапы на опору, реакции хватания, реакции удержания равновесия, реакции сгибания задней конечности ( и соавт., 1991). У животных проведена оценка мнестической и антигипоксической активности следующих препаратов:

● официнальных галеновых растительных адаптогенов - экстракта солодки (2 мл/кг), экстракта родиолы розовой (2 мл/кг) и экстракта женьшеня (2 мл/кг);

● ОНК-7 (10 мг/кг) - производного оксиникотиноилгаммааминомасляной кислоты и ОНКмг/кг) - производного оксиникотиноилглутаминовой кислоты;

Препаратами сравнения служили ноотропы пирацетам (ноотропил Polfa) (50-200 мг/кг) и меклофеноксат (100 мг/кг), антигипоксант натрия оксибутират (50 мг/кг). Все исследованные вещества растворяли в физиологическом растворе, в случае низкой растворимости - с добавлением твин - 80 и вводили внутрибрюшинно. Вещества вводили в трех экспериментальных ситуациях: интактным животным без гипоксического воздействия, до помещения животных в гермокамеру и в ранний постгипоксический период.

Cтатистическая обработка данных проведена с использованием программы «Биостат». Соответствие полученных данных гаусовскому распределению определяли по критерию Фишера. Оценку достоверности различий проводили по критерию (t) Стьюдента и непараметрическому критерию (U) Манна - Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние острой нормобарической гипоксии на выработку поведенческих реакций. Изучение устойчивости крыс к острой нормобарической гипоксии с гиперкапнией выявило, что у интактных животных резервное время в среднем составило 43,5±2,2 мин. С учетом этого влияние острой гипоксии на процессы выработки различных адаптивных поведенческих реакций исследовали после 40 минутного пребывания в гермокамере. Установлено, что дозированная нормобарическая гипоксия вызывала выраженное угнетение скорости выработки адаптивных поведенческих ответов. Наибольшую чувствительность к гипоксии обнаружили процессы обучения УРАИ и РПЧ, скорость которых снизилась на 115-154%. Напротив, выработка РПД и УРЗД ухудшалась в среднем на 33-40% (таблица 1). Анализ показал, что в наибольшей степени страдает процесс становления адаптивных реакций, что проявлялось снижением скорости появления первых 2-х правильных ответов. Динамика поисковой активности животных была значительно изменена при обучении УРЗД и РПЧ (таблица 1). После гипоксического воздействия на 14,1% замедляется скорость переделок пространственных дифференцировок (контроль - 97,06±2,8 проб и опыт - 110,7±4,12, Р <0,01) и на 219% зрительных дифференцировок (контроль - 124,8±12,8 проб и опыт – 182,8±19,8, Р <0,01).

Таким образом, гипоксия вызывала выраженное нарушение мнестических и когнитивных процессов, проявляющееся затруднением процесса вычленения биологически значимого сигнала, установления причинно-следственных отношений и угнетением формирования и консолидации энграм реакций.

Таблица 1.

Влияние 40-минутной гипоксии на выработку поведенческих реакций у крыс

Виды поведенческих реакций n - число животных	Условия обучения	Количество проб, затраченных на обучение	Время поиска (сек.)
До 2-х ответов	До критерия	1 проба	3проба
Условная реакция активного избегания n= 34	Норма	9,5±0,6	12,2±0,9	27,03±2,3	10,7±0,5
Гипоксия	28,8±0,3**	31,05±0,8**	26,9±2,2	13,7±0,8
Пространственная дифференцировка n=25	Норма	23,2±0,9	27,7±1,4	75,3±1,5	40,4±9,9
Гипоксия	29,6 ± ,18*	36,8±1,92**	154,7±19,0*	68,2±17,0
Реакция зрительной дифференцировки n=37	Норма	11,2±0,5	32,3±2,3	28,4±1,2	7,7±0,7
Гипоксия	26,3±0,8**	45,2±2,2**	25,6 ± 1,4	28,4 ± 1,2
Реакция последовательного чередования n=25	Норма		38,8±2,8	26,3±1,9	10,7±1,6
Гипоксия		84,7±1,6**	38±2,1*	28±1,9*

Примечание. Значимость различий контроль (интактные крысы) – опыт (нормобарическая гипоксия): * при Р<0,05 и ** при Р<0,01.

Изучение неврологического дефицита после воздействия гипоксии проведено у мышей. Установлено, что острая гипоксия не вызывала каких-либо изменений выполнения безусловных рефлексов: реакции сгибания, рефлекса переворачивания, роговичного рефлекса, реакция хватания, реакция удержания равновесия. Вместе с тем, выявлено увеличение времени выполнения реакции избавления, что, вероятно, связано с угнетающим влиянием гипоксии на эффективность мотивационного поиска и эмоционального подкрепления.

Влияние ноотропов на выработку адаптивных поведенческих реакций в условиях гипоксии. Характер действия препаратов на процессы обучения и запоминания у интактных животных и животных, подвергнутых воздействию гипоксии, отчетливо зависит от вида поведенческих реакций. Введение пирацетама (50 мг/кг), ОНК-7 (10 мг/кг) и антигипоксанта натрия оксибутирата (50 мг/кг) не оказывало влияния на скорость становления поведенческой реакции УРАИ у интактных животных. Об этом свидетельствует отсутствие сдвигов в количестве проб, после которых появлялись два правильных ответа УРАИ. Увеличение скорости становления вызывал исключительно ОНК-10. Вместе с тем, меклофеноксат и ОНК-10 значительно ускоряли (на 25-32%) выработку УРАИ у интактных животных. Пирацетам и натрия оксибутират не влияли, а ОНК-7 замедлял достижение критерия обучения УРАИ (таблица 2). Введение ноотропов после гипоксии приводило к восстановлению скорости становления реакции активного избегания.

Препараты восстанавливали различение сигнального значения условного звукового стимула и уменьшали количество проб, необходимых для достижения 2-х правильных ответов. Вместе с тем, ОНК-10, меклофеноксат и пирацетам повышали скорость выработки активного избегания по сравнению с контролем. ОНК-7 и натрия оксибутират не приводили к нормализации процессов выработки адаптивных ответов нарушенных гипоксией. Оба антигипоксанта ухудшали поиск безопасного отсека в первых 3 пробах (таблица 2). Введение пирацетама, ОНК-10 и натрия оксибутирата до гипоксического воздействия облегчало процесс становления и упрочения простого поведенческого ответа.

Таким образом, ноотропное действие проявляется у меклофеноксата и ОНК-10 при их введении интактным животным и в постгипоксический период, пирацетама до и после гипоксии, натрия оксибутирата до гипоксии.

Таблица 2.

Влияние ноотропов на выработку условной реакции активного избегания у крыс при их введении в ранний постгипоксический период

Препарат и его доза	Условия Опыта	Количество проб, затраченных на обучение	Время поиска (сек.)
До 2-х правильных ответов	До критерия обучения	1 проба	3 проба
Физ. р-р n=32	Норма	9,5±0,5	12,0±0,9	27,03±2,3	10,7±0,5
гипоксия	28,8±2,3	31,5±1,1	26,9±2,2	13,7±0,8
Пирацетам 50 мг/кг n =16	Норма	9,8±0,5	10,8±1,3	34,5±5,9	7,2±2,2
гипоксия	9,5±0,6**	11,2±0,8**	26,03±2,1	10,4±0,3
Меклофеноксат 100 мг/кг n=14	Норма	7,0±1,4	8,2±1,2*	32,9±7,6	17,3±1,1
гипоксия	7,5±0,9**	18,7±1,3**	30,2±4,6	19,3±3,1
ОНК -10 10 мг/кг n=16	Норма	6,0±0,6*	9,0±0,9*	22,3±4,8	7,4±1,7
гипоксия	10,9±0,9*	16,7±2,1**	22,3±4,8	7,4±1,7
ОНК-7 10 мг/кг n=14	Норма	11,3±0,9	22,3±3,7**	48,5±4,3**	20,9±3,6**
гипоксия	13,2±1,1**	28,5±2,5	58,6±5,7**	39,7±4,5**
Натрий оксибутират 50 мг/кг п=18	Норма	8,7±0,8	14,8±1,4	38,6±1,7*	9,7±1,5
Гипоксия	11,4±1,4**	26,8±2,1	32,1±2,9	8,9±2,1

Примечание. Значимость различий контроль (интактные крысы) – опыт (препарат) и контроль (после гипоксии) – опыт (гипоксия + препарат): * при Р<0,05 и ** при Р<0,01