Введение фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата беременным самкам в обеих дозах не повлияло на уровень постимплантационной смертности. Количество жизнеспособных плодов в расчете на одну самку в подопытных группах статистически не отличалось от контрольной, мертвых плодов не было.
При изучении развития костной системы во всех группах, включая контрольную, выявлены единичные случаи задержки оссификации подъязычной кости и некоторых сегментов грудины (таблица 3), что соответствует нормальному уровню для данного вида животных на исследуемом сроке беременности.
Таблица 3
Результаты исследования аномалий развития костной системы плодов в конце антенатального периода
Доза (мг/кг) | Кол-во обследованных плодов | Отсутствие оссификации (абс./ %) | ||
подъязычной кости | 5-го сегмента грудины | 6-го сегмента грудины | ||
ДМСО | 52 | 3/13,5 | 3/5,8 | 4/7,7 |
3,0 | 32 | 5/15,6 | - | 2/6,3 |
20,0 | 47 | 5/10,6 | 2/4,3 | 2/4,3 |
При изучении состояния внутренних органов плодов методом серийных срезов выявлены единичные случаи гидронефроза и полнокровия сосудов легких (таблица 4).
Таблица 4
Результаты исследования аномалий развития органов плодов
в конце антенатального периода
Доза, (мг/кг) | Количество обследованных плодов | Количество плодов с аномалиями (абс./ %) | |
Гидронефроз | Полнокровие сосудов в легких | ||
ДМСО | 56 | 1/1,8 | 0/0 |
3,0 | 33 | 0/0 | 0/0 |
20,0 | 43 | 0/0 | 2/4,6 |
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенным исследованием не установлено признаков эмбриотоксического и тератогенного действия лекарственной субстанции фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат при внутримышечном введении крысам Wistar на всем протяжении беременности в дозах до 20,0 мг/кг массы тела.
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
ПРОТОКОЛ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изучение эмбриотоксического действия субстанции лекарственного препарата Фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота)гидрат при внутримышечном введении крысам
Код исследования: AG0409
Код вещества: 1509
Заказчик:
г. Чкаловск Нижегородской области, ул. Пушкина, 36
Представитель заказчика:
, Управляющий
Тел.: 8 (83
Организация-исполнитель:
Федеральное государственное учреждение науки «Научно-исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства (ФГУН НИЦ ТБП ФМБА).
142253 Россия, Московская обл., Серпуховский р-н, о/с Дашковка, -А
тел./
Руководитель исследования:
, научный сотрудник отдела патоморфологии и репродуктивной токсикологии НИЦ ТБП
Тел.: (49
1. Ключевые даты исследования
Дата начала исследования: январь 2010 г.
Дата окончания исследования: август 2010 г.
Дата начала экспериментов: февраль 2010 г.
Дата окончания экспериментов: май 2010 г.
2. Ответственные за выполнение этапов исследования:
· Формирование групп животных – В., научный сотрудник отдела патоморфологии и репродуктивной токсикологии
· Введение препарата и клинические наблюдения – В., научный сотрудник отдела патоморфологии и репродуктивной токсикологии
· Некропсия и визуальный анализ плодов – В., научный сотрудник отдела патоморфологии и репродуктивной токсикологии
· Анализ внутренних органов плодов – В., научный сотрудник отдела патоморфологии и репродуктивной токсикологии
· Анализ скелета плодов – В., научный сотрудник отдела патоморфологии и репродуктивной токсикологии
· Обеспечение качества исследований – , начальник лаборатории обеспечения качества токсикологических исследований
3. Цель исследования
Экспериментальная оценка параметров эмбриотоксического действия субстанции лекарственного препарата фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат при внутримышечном введении крысам с 1 по 19-й день беременности.
4. Регулирующие стандарты
План исследования составлен в соответствии со следующими документами:
- «Методические указания по изучению репродуктивной токсичности фармакологических веществ» /Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. . ― 2-изд., перераб. и доп. ― М.: ОАО "Издательство "Медицина", 2005. - С.87-100. Методические указания по гигиенической оценке новых пестицидов. Киев, 1988, утв. МЗ СССР 13.03.1987, N 4263-87. Prenatal Developmental Toxicity Study. OECD guideline for the testing of chemicals. Proposal for updating guideline 414. Adopted : 22nd January 2001.
Все процедуры в исследовании будут выполняться согласно данному письменному протоколу после его утверждения и стандартным операционным процедурам (СОП).
4.2. Обеспечение соблюдения принципов гуманного обращения с подопытными животными
По материалам данного исследовательского протокола составляется ветеринарный протокол, который подается для экспертизы и утверждения в Комиссию по биоэтике НИЦ ТБП. Приобретение животных для исследования осуществляется после утверждения ветеринарного протокола.
К работе с подопытными животными допускаются сотрудники, имеющие соответствующую квалификацию и прошедшие обучение. На протяжении исследования все манипуляции с животными проводятся только по процедурам, утвержденным в протоколе.
5. Обоснование выбора тест-системы и условий введения тестируемого вещества
В данном исследовании в качестве тест-системы будут использованы крысы линии Wistar, которые являются стандартным объектом токсикологических исследований.
Количество животных в каждой подопытной и контрольной группе будет составлять не менее 12 самок с известным сроком оплодотворения в каждой группе.
Исследуемое вещество будет вводиться животным внутримышечно, как и предполагается при лечении человека.
Общие условия проведения эксперимента
Группа № | Количество животных | Номера животных | Основные условия дозирования | Режим введения | |||
Вещество | Доза (мг/кг) | Концентрация (мг/мл) | Объем введения (мл) на 200 г массы тела животного | ||||
1 | Не менее 12* | 1-15 | ДМСО | 20 | 20 | 0,2 | Внутри-мышечно, один раз в день |
2 | Не менее 12 | 16-30 | 1509 | 3 | 3,0 | 0,2 | |
3 | Не менее 12 | 31-45 | 1509 | 20 | 20,0 | 0,2 |
Примечание: фактическое количество крыс в каждой группе, при условии равного распределения, будет зависеть от результатов контролируемого спаривания и составит от 12 до 15 особей
6. Характеристика исследуемых веществ
6.1. Тестируемое вещество: Фуллерен-(трисаминокапроновая кислота) гидрат
Производитель:
Физико-химические свойства:
Формула: С 60 (H)n (NH(CH2)5COOH) 1-6 • 10 Н2О
Описание: Субстанция представляет собой кристаллическое вещество от
коричневого до темно-коричневого цвета.
Физические свойства: температура разложения без плавления 400-450 °С
Растворимость:
• Легко растворим в ДМСО (диметилсульфоксиде)
• Растворим в диметилформамиде ( 10 мг субстанции в 10 мл ДМФ)
• Практически не растворим в воде, 95% этиловом спирте, 1,2-
дихлорбензоле
рН: 5,2
Аминокапроновая кислота: 3 - 3,5 %
Хлориды: не более 0,2%
Общая зола: не более 0,5%
Тяжелые металлы: не более 0,001 %
Остаточные растворители: 1,2-дихлорбензол – не более 0,036%
Содержание азота: 4,5 %
Элементный анализ:
%С – 73,30
%Н – 4,10
%N – 4,60
%С1 – 0,2
6.2. Контрольное вещество (растворитель)
Название: Диметилсульфоксид (ДМСО)
Партия: 107
Дата изготовления: 10.2008
Срок годности: 2 года
Для введения животным ДМСО будет применяться в виде 20%-ного водного раствора
6.3. Характеристика тестируемого вещества при исследовании
Препарат изготовлен Заказчиком в соответствии с проектом фармакопейной статьи предприятия. Заказчик отвечает за компонентный анализ и характеристику стабильности вещества.
6.4. Учет тестируемого вещества
Выдача препарата осуществляется согласно представленному Требованию под роспись. Ежедневный расход препарата должен соответствовать суммарному объему разовых суточных доз, рассчитанных на основании определения массы тела животных. Допустимое превышение расхода ― 20%.
6.5. Образцы веществ
В данном исследовании образцы тестируемого и контрольного веществ хранятся при соблюдении требуемых условий в хранилище провизорской группы. Ответственный за хранение и выдачу ― .
6.6. Обеспечение безопасных условий работы с тестируемым веществом
Специальных мер безопасности не требуется. При работе с тестируемым веществом следует избегать попадания препарата на кожные покровы и слизистые оболочки. В случае попадания промыть загрязненный участок теплой водой с мылом.
6.7. Уничтожение тестируемого вещества
Остатки вещества в кристаллической форме могут быть возвращены Заказчику по его требованию. Остатки растворов вещества будут утилизированы путем слива жидкости в канализацию.
6.8. Подготовка вещества для введения животным
Прописи приготовления растворов фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата для введения животным:
3. Приготовление 100 мл раствора фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата с концентрацией 20,0 мг/мл:
2000 мг фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата растворить в 20 мл ДМСО. После полного растворения кристаллов субстанции объем раствора довести до 100 мл дистиллированной водой.
4. Приготовление 100 мл раствора фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата с концентрацией 3,0 мг/мл:
300 мг фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата растворить в 20 мл ДМСО. После растворения субстанции объем раствора довести до 100 мл дистиллированной водой.
Пропись приготовления контрольного вещества (растворителя):
К 20 мл ДМСО добавить дистиллированную воду до объема 100 мл.
Растворы тестируемого и контрольного вещества готовятся провизорской службой перед введением в асептических условиях в объемах, отражаемых исследователем в заявке. Растворы фасуются в промаркированные флаконы, объем которых указан в заявке.
Расчеты по приготовлению доз являются первичными данными и подлежат архивированию.
7. Животные
Вид: крыса (Rattus sp.)
Линия/сток: Wistar
Поставщик: питомник ГУ НЦБТ РАМН филиал «Столбовая»
Количество: самцы – 20 голов, самки – 45 голов
К началу спаривания животные должны иметь массу тела: самцы – 230-250 г, самки – 210-230 г.
Чтобы получить крыс с известным сроком беременности, вечером самцов подсаживают к самкам (1 самец на 2 самки). Утром следующего дня влагалищные мазки еx tempore просматривают под микроскопом. Присутствие сперматозоидов в мазке свидетельствуют о произошедшем спаривании и возможном наступлении беременности. День, когда факт спаривания был установлен, считают 1 днем беременности.
7.1. Условия содержания и кормления
Животные будут содержаться в отдельной комнате, животные других видов в этой комнате находиться не будут. Основные правила содержания и ухода соответствуют нормативам "Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев), утвержденным МЗ СССР 06.07.73 г., а также условиям, приведенным в Руководстве "Guide for Care and Use of Laboratory Animals" (ILAR publication, 1996, National Academy Press, USA). Все процедуры по рутинному уходу за животными выполняются в соответствии с СОП вивария. Выполнение рутинных процедур документируется.
7.1.1. Клетки
Крысы будут размещаться в клетках из поликарбоната (Тип-4) на стеллажах из нержавеющей стали фирмы LabProdex USA по 5-6 особей в клетке. Клетки оборудованы стальными решетчатыми крышками с углублением, стальными разделителями для корма и стальными держателями этикеток.
7.1.2. Подстил
В качестве подстила используются древесные опилки смешанных пород деревьев. Толщина слоя подстила в клетке ― 15-20 мм. Санитарно-бактериологической лабораторией периодически осуществляется анализ подстилки на микробиологическую контаминацию. Данные о результатах анализов хранятся в документации лаборатории.
7.1.3. Корм
Для кормления животных будет применяться стандартный экструдированный корм фирмы OOO "Лабораторкорм" (Россия). Корм для свободного неограниченного доступа будет даваться в кормовое углубление стальной решетчатой крышки клетки. Санитарно-бактериологической лабораторией периодически осуществляется анализ корма на микробиологическую контаминацию. Данные о результатах анализов хранятся в документации лаборатории.
7.1.4. Вода
Животные будут получать воду, соответствующую ГОСТу "Вода питьевая" 28.74–73. Подготовленная фильтрованная водопроводная вода будет даваться в стандартных автоклавированных питьевых бутылочках со стальными крышками-носиками. Подготовка воды обеспечивает отсутствие контаминации, способной повлиять на результаты исследования. Санитарно-бактериологической лабораторией периодически осуществляется анализ воды на микробиологическую контаминацию. Данные о результатах анализов хранятся в документации лаборатории.
7.1.5. Параметры окружающей среды
Животные будут содержатся в контролируемых условиях окружающей среды при температуре 18-22°С и относительной влажности воздуха 30-70%. Температура и влажность постоянно контролируются в каждой экспериментальной комнате и вручную один раз в день записываются в специальную форму, находящуюся в данном помещении. В комнатах содержания животных соблюдается 12 часовой цикл освещения день-ночь и 18-ти кратная смена объема воздуха комнаты в час.
7.1.6. Карантин или адаптация
Полученные животные до начала исследования будут содержаться не менее 7 дней для адаптации при групповом содержании в клетках. Во время этого периода у животных дважды в день будут контролироваться клиническое состояние путем визуального осмотра. При обнаружении у отдельных особей отклонений в состоянии здоровья, они будут отсажены в отдельные клетки, о чем будет доложено руководителю исследования и ветеринару для принятия мер.
7.1.7. Распределение по группам
Каждый день, когда проводится определение результатов спаривания, всех самок с подтвержденным фактом спаривания делят в равном количестве по группам, согласно п. 5 настоящего Протокола. Животных следует распределять по группам рандомизированно, используя в качестве основного критерия массу тела, так, чтобы различия в массе тела между особями в одной группе не превышали 20%.
7.1.8. Идентификация животных
После установления 1 дня беременности (подтвержденное спаривание) каждому животному будет присваиваться индивидуальный номер в соответствии с таблицей п. 5 настоящего Протокола, который будет наноситься несмываемым маркером ближе к корню хвоста с дорсальной стороны. Индивидуальные номера животных фиксируют на карточке клетки.
7.1.9. Запасные животные
Животные, оставшиеся после формирования экспериментальных групп, а также самцы, подсаживаемые для спаривания с самками, после окончания формирования групп беременных самок будут помещены в другую комнату и будут использованы для других целей.
8. Методы исследования
8.1. Прижизненные манипуляции с животными
8.1.1. Введение веществ
Способ введения | Внутримышечно |
Частота введения | Ежедневно, один раз в день |
Продолжительность | С 1 по 19-й день беременности |
Коррекция дозы | После взвешивания в 5, 12 и 16-й день беременности |
8.1.2. Внешний вид
Учет общего состояния животных будет проводиться один раз в день непосредственно перед введением вещества в первой половине дня.
8.1.3. Клинический осмотр
При отсутствии внешних признаков неблагополучия в состоянии животных, подробный клинический осмотр каждого животного будет проводиться еженедельно. В случае установления отклонений в состоянии животных, клинический осмотр будет проводиться ежедневно, а в случае стремительного развития неблагоприятных признаков ― не менее 2-х раз в день.
Все первичные данные клинического осмотра фиксируются документально.
8.1.4. Масса тела
Масса тела животных будет измеряться в 1, 5, 12, 16 и 20-й день беременности.
8.1.5. Потребление корма
Ежедневно визуально будет оцениваться потребление корма и воды животными в отдельных клетках. В случае явно заметного изменения в потреблении, необходимо определить суточный объем потребления путем взвешивания начального и конечного (спустя сутки) количества корма и соответствующего измерения объема воды.
8.2. Животные в тяжелом состоянии и умершие во время исследования
Если животное погибает во время исследования, необходимо, насколько это возможно, определить точное время смерти и безотлагательно провести некропсию. Если некропсия в данный момент невозможна, труп помещают в холодильник при температуре +4°С не более чем на 12 часов.
Животное в тяжелом состоянии может быть подвергнуто эвтаназии по решению руководителя исследования, после консультации с ветеринарным врачом.
8.3. Эвтаназия
Беременных крыс подвергают эвтаназии на 20-й день беременности. В качестве метода эвтаназии используют ингаляцию углекислым газом (CO2) с последующей цервикальной дислокацией.
8.4. Сбор образцов для исследования
8.4.1. Оценка параметров эмбриотоксического и тератогенного действия
При вскрытии брюшной полости извлекают матку и определяют:
· количество желтых тел в яичниках
· общее количество плодов
· общее количество имплантаций
· количество живых и мертвых плодов
· количество ранних или поздних резорбций
· количество самок и самцов в помете
· массу каждого плода
· кранио-каудальный размер каждого плода
· возможные внешние отклонения в развитии или наличие уродств у плодов
После визуального осмотра примерно половину плодов из каждого помета помещают в 96о этанол, вторую половину – в жидкость Буэна.
Матки животных, в которых при вскрытии не выявлено плодов или различимых мест имплантации, следует извлечь и окрасить по Салевски для визуализации мест имплантации в случае, если имеют место полные ранние резорбций.
8.4.2. Изучение состояния скелета и внутренних органов плодов
У фиксированных в этаноле плодов оценивают развитие скелета по методу Доусона (в модификации НИИЭМ АМН СССР) в соответствии с СОП.. У плодов, фиксированных в жидкости Буэна, изучают состояние внутренних органов по методу Вильсона (в модификации НИИЭМ АМН СССР) в соответствии с СОП.04-68-1.
9. Статистический анализ данных
Для всех данных будет применен метод параметрического или непараметрического анализа, позволяющего сравнить две независимые выборки парных наблюдений и установить степень достоверности выявленных различий. Различия будут определены при уровне доверительной вероятности 95%.
10. Поправки к протоколу
Необходимость поправки к протоколу обсуждается с Заказчиком. Изменение документируется, подписывается представителем Заказчика и руководителем исследования, датируется. Персонал ставится в известность об утвержденном изменении и дате вступления изменения в силу. Все изменения протокола прикладываются к протоколу и отчету.
11. Отклонения от протокола
Все отклонения от протокола документируются руководителем исследования, и анализируется их влияние на ход исследования. К отчету прикладывается список отклонений, которые могли бы повлиять на результаты исследования.
12. Отчет
Отчет передается Заказчику после завершения всех исследований и анализа материала. Отчет представляет исчерпывающие данные по исследованию по всем пунктам, отраженным в протоколе. Протокол исследования, поправки к нему и отклонения включают в приложение к отчету.
13. Документация и архивирование
Все данные и документация, относящаяся к исследованию, будут комплектоваться в папки исполнителями отдельных этапов. После подписания итогового отчета руководитель исследования проверяет полноту представляемых для архивирования данных и материалов и обеспечивает их передачу в архив НИЦ ТБП. Срок хранения архивных материалов — 2 года с даты завершения исследования.
Перечень данных и материалов, передаваемых в архив:
§ Протокол, поправки к нему и отклонения
§ Данные о тестируемом веществе
§ Документация по приобретению животных у поставщика и их здоровью
§ Формирование групп
§ Записи клинического наблюдения за животными
§ Масса тела
§ Результаты некропсии
§ Результаты оценки параметров эмбриотоксического и тератогенного действия
§ Письма и другая письменная информация, касающаяся исследования
§ Итоговый отчет
ПРИЛОЖЕНИЕ 2
ИНДИВИДУАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ МАССЫ ТЕЛА КРЫС
Индивидуальные данные массы тела крыс при внутримышечном введении
фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота)гидрата
Доза, мг/кг | № жив. | Масса тела крыс в течение эксперимента, г | ||||
1 день | 6 день | 12 день | 16 день | 20 день | ||
ДМСО | 1 | 213 | 233 | 265 | 300 | 369 |
2 | 182 | 198 | 224 | 264 | 295 | |
3 | 198 | 224 | 249 | 276 | 341 | |
4 | 267 | 280 | 294 | 320 | 347 | |
5 | 244 | 257 | 272 | 293 | 328 | |
7 | 242 | 256 | 284 | 318 | 393 | |
8 | 217 | 246 | 275 | 297 | 337 | |
9 | 264 | 293 | 336 | 361 | 418 | |
10 | 204 | 235 | 256 | 294 | 338 | |
12 | 201 | 213 | 237 | 249 | 268 | |
13 | 242 | 257 | 290 | 316 | 362 | |
3,0 | 16 | 220 | 233 | 260 | 299 | 353 |
19 | 178 | 201 | 232 | 269 | 314 | |
23 | 201 | 213 | 225 | 241 | 258 | |
26 | 203 | 231 | 263 | 286 | 335 | |
27 | 252 | 270 | 296 | 315 | 365 | |
28 | 212 | 225 | 257 | 269 | 315 | |
29 | 232 | 249 | 277 | 303 | 338 | |
20,0 | 31 | 218 | 238 | 271 | 305 | 350 |
33 | 199 | 221 | 246 | 281 | 326 | |
35 | 246 | 258 | 277 | 281 | 278 | |
36 | 214 | 230 | 254 | 290 | 314 | |
38 | 204 | 213 | 234 | 270 | 310 | |
39 | 227 | 245 | 275 | 315 | 378 | |
40 | 244 | 261 | 282 | 283 | 313 | |
41 | 207 | 222 | 266 | 275 | 321 | |
42 | 232 | 232 | 254 | 257 | 288 | |
44 | 208 | 216 | 243 | 271 | 295 | |
ПРИЛОЖЕНИЕ 3
ИНДИВИДУАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЭМБРИОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ
Индивидуальные данные показателей эмбриотоксического действия фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота)гидрата при внутримышечном введении крысам
Доза, мг/кг | № жив. | Основные показатели гестации | |||
Кол-во желтых тел | Кол-во мест имплантации | Кол-во живых плодов | Кол-во резорбций | ||
ДМСО | 1 | 14 | 14 | 14 | 0 |
2 | 12 | 7 | 7 | 0 | |
3 | 12 | 10 | 10 | 0 | |
4 | 13 | 11 | 11 | 0 | |
5 | 10 | 3 | 3 | 0 | |
7 | 14 | 14 | 14 | 0 | |
8 | 14 | 13 | 13 | 0 | |
9 | 14 | 14 | 14 | 0 | |
10 | 13 | 13 | 13 | 0 | |
13 | 12 | 10 | 9 | 1 | |
3,0 | 16 | 16 | 15 | 15 | 0 |
19 | 12 | 10 | 10 | 0 | |
23 | 6 | 2 | 2 | 0 | |
26 | 13 | 13 | 12 | 1 | |
27 | 9 | 9 | 9 | 0 | |
28 | 10 | 8 | 8 | 0 | |
29 | 9 | 9 | 9 | 0 | |
20,0 | 31 | 13 | 13 | 13 | 0 |
33 | 11 | 11 | 10 | 1 | |
36 | 11 | 10 | 10 | 0 | |
38 | 11 | 11 | 11 | 0 | |
39 | 16 | 15 | 15 | 0 | |
40 | 12 | 6 | 5 | 1 | |
41 | 13 | 13 | 13 | 0 | |
42 | 8 | 3 | 3 | 0 | |
44 | 10 | 10 | 10 | 0 |
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 |
