Изучение эмбриотоксического действия в антенатальном периоде лекарственной субстанции фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат при внутримышечном введении крысам (стр. 1 )

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР ТОКСИКОЛОГИИ И

ГИГИЕНИЧЕСКОЙ РЕГЛАМЕНТАЦИИ БИОПРЕПАРАТОВ

(ФГУН НИЦ ТБП ФМБА)

УТВЕРЖДАЮ: Директор ФГУН НИЦ ТБП ФМБА Д. м.н., профессор __________________ “___”______________ 2011 г.

ОТЧЕТ

Изучение эмбриотоксического действия в антенатальном периоде лекарственной субстанции фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат при внутримышечном введении крысам

Руководитель исследования,

научный сотрудник отдела патоморфологии

и репродуктивной токсикологии

“___”_______________ 2011 г.

Серпухов 2011

СПИСОК ИСПОЛНИТЕЛЕЙ

Научный сотрудник
Лаборант-исследователь
Лаборант-исследователь
Лаборант-исследователь
Лаборант-исследователь
Лаборант-исследователь

Содержание

Стр.

ВВЕДЕНИЕ		5
1.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ		5
1.1. Общие условия проведения исследования		5
1.2. Условия проведения ключевых фаз исследования		8
2.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ		9
ЗАКЛЮЧЕНИЕ		11
ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Протокол исследования		12
ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Индивидуальные данные массы тела		21
ПРИЛОЖЕНИЕ 3. Индивидуальные данные показателей эмбриотоксического действия		22

РЕФЕРАТ

Объем отчета – 11 страниц, таблиц – 4, приложений – 3 на 11 страницах.

Ключевые слова: фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат, эмбриотоксическое действие, внутримышечное введение, крысы Wistar

Целью исследования явилась экспериментальная оценка параметров эмбриотоксического действия в антенатальном периоде лекарственной субстанции фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат при внутримышечном введении крысам с 1 по 19-й день беременности.

Фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат вводили беременным крысам Wistar внутримышечно, ежедневно с 1 по 19-й день беременности, один раз в день в двух дозах – 3,0 мг/кг и 20,0 мг/кг массы тела. При патологоанатомическом вскрытии, проведенном на 20 сутки беременности при внешнем обследовании извлеченных плодов ни в одной из изучаемых групп не было обнаружено аномалий и пороков развития. Показатели таких параметров оценки эмбриотоксического действия, как количество желтых тел в яичниках и число мест имплантации, а, следовательно, и предимплантационная смертность зародышей, в подопытных и контрольной группах статистически достоверных отличий не имели.

При изучении развития костной системы во всех группах, включая контрольную, выявлены немногочисленные задержки оссификации подъязычной кости и отдельных сегментов грудины. Характер и общий уровень задержки оссификации указанных зон в контроле и подопытных группах существенно не отличались, и соответствовали нормальному уровню оссификации для данного срока беременности у крыс. В исследовании внутренних органов плодов выявлены единичные случаи гидронефроза и полнокровия сосудов в легких, что не выходит за рамки нормального уровня спонтанных аномалий для данного вида животных.

Таким образом, проведенным исследованием не установлено признаков эмбриотоксического и тератогенного действия лекарственной субстанции фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат при внутримышечном введении крысам в дозах до 20 мг/кг массы тела с 1 по 19 день беременности.

ВВЕДЕНИЕ

Целью исследования явилась экспериментальная оценка параметров эмбриотоксического действия в антенатальном периоде лекарственной субстанции фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат при внутримышечном введении крысам с 1 по 19-й день беременности.

Субстанция фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата представляет собой производное фуллерена и аминокапроновой кислоты. Субстанция не растворима в воде, поэтому для ее растворения используют диметилсульфоксид (ДМСО), с последующим разведением водой до необходимой концентрации.

Фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат исследовали в двух дозах – 3,0 и 20,0 мг/кг. Контрольной группе животных внутримышечно вводили раствор ДМСО.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1.1. Общие условия проведения исследования

Регулирующие стандарты

Исследование выполнено согласно следующим документам:

"Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации № 000 от 01.01.2001). "Методическим указаниям по изучению репродуктивной токсичности фармакологических веществ./Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред-ей проф. . ― 2-изд., перераб. и доп. ― М.: ОАО "Издательство "Медицина", 2005. ― С.87-100. Методическим указания по гигиенической оценке новых пестицидов. Министерство здравоохранения СССР. ВНИИ Гигиены и токсикологии пестицидов, полимеров и пластиковых масс, Киев, 1988 Prenatal Developmental Toxicity Study. OECD guideline for the testing of chemicals. Proposal for updating guideline 414. Adopted : 22nd January 2001.

Тестируемое вещество

Вводимое вещество представляет собой субстанцию в виде кристаллического вещества от коричневого до темно-коричневого цвета. Субстанция нерастворима в воде, поэтому для её растворения используют диметилсульфоксид (ДМСО).

Приготавливается Провизорской группой, стерилизуется, хранится при 4оС.

Контрольное вещество (носитель)

Название: диметилсульфоксид (ДМСО)

Хранится при 4оС.

Прописи приготовления растворов фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата для введения животным:

1.  Приготовление 100 мл раствора фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата с концентрацией 20,0 мг/мл:

2000 мг фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата растворить в 20 мл ДМСО. После полного растворения кристаллов субстанции объем раствора довести до 100 мл дистиллированной водой.

2.  Приготовление 100 мл раствора фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата с концентрацией 3,0мг/мл:

300 мг фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата растворить в 20 мл ДМСО. После растворения субстанции объем раствора довести до 100 мл дистиллированной водой.

Пропись приготовления контрольного вещества (растворителя):

К 20 мл ДМСО добавить дистиллированную воду до объема 100 мл.

Животные

Вид: крыса (Rattus sp.)

Линия/сток: Wistar

Поставщик: питомник ГУ НЦБТ РАМН филиал «Столбовая»

Условия содержания

Животных содержали в отдельной комнате при температуре 20-22°С и относительной влажности воздуха 50-60%. В течение экспериментов соблюдали 12 часовой цикл освещения день-ночь и обеспечивали 15-ти кратную смену объема воздуха комнаты в час Основные правила содержания и ухода соответствовали нормативам "Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев), утвержденным МЗ СССР 06.07.73 г., а также условиям, приведенным в Руководстве "Guide for Care and Use of Laboratory Animals" (ILAR publication, 1996, National Academy Press, USA).

Клетки

Крыс размещали в клетках из поликарбоната (Тип-4) на стеллажах из нержавеющей стали фирмы LabProdex USA. Клетки были оборудованы стальными решетчатыми крышками с углублением, стальными разделителями для корма и стальными держателями этикеток.

Подстил

В качестве подстила использовали древесные опилки смешанных пород деревьев. Толщина слоя подстила в клетке ― 15-20 мм.

Корм

Для кормления животных применяли стандартный экструдированный корм фирмы OOO "Лабораторкорм" (Россия). Корм для свободного неограниченного доступа давали в кормовое углубление стальной решетчатой крышки клетки.

Вода

Животные получали воду, соответствующую ГОСТу "Вода питьевая" 28.74–73, в стандартных автоклавированных питьевых бутылочках со стальными крышками-носиками.

Карантин или адаптация

Закупленных животных до начала исследования содержали 7дней для адаптации при групповом содержании в клетках. Во время этого периода у животных дважды в день контролировали клиническое состояние путем визуального осмотра.

Получение животных с известным сроком беременности

Чтобы получить крыс с известным сроком беременности, с вечера самцов подсаживали к самкам (1 самец на 2 самки). Утренние нативные мазки с вагинальным содержимым анализировали под микроскопом. Факт спаривания устанавливали по присутствию сперматозоидов в мазке. День, когда факт оплодотворения был установлен, считали 1 днем беременности.

Распределение по группам

Каждый день, когда проводилось определение результатов спаривания, всех самок с подтвержденным фактом спаривания делили в примерно равном количестве по экспериментальным группам. Животных распределяли по группам рандомизировано, используя в качестве основного критерия массу тела, так, чтобы различия в массе тела между особями в одной группе не превышали 20%.

Идентификация животных

Крысам присваивали индивидуальные номера, которые наносили несмываемым маркером ближе к корню хвоста с дорсальной стороны. Индивидуальные номера отображали на карточке клетки, где содержали животных.

1.2. Условия проведения ключевых фаз исследования

На основании анализа мазков, было набрано две экспериментальные (по 14 животных) и одна контрольная (13 животных) группы.

Исследуемое вещество вводили животным внутрижелудочно, ежедневно с 1 по 19-й день беременности, один раз в день, в дозах 3,0 мг/кг и 30,0 мг/кг массы тела. Контрольная группа крыс получала водный раствор ДМСО в объеме, соответствующем объему максимальной дозы исследуемого препарата в расчете на 1 кг массы тела.

Для изучения аномалий и пороков развития, выявляемых в антенатальном периоде, на 20 сутки после спаривания беременных самок подвергали эвтаназии и проводили их вскрытие. При вскрытии брюшной полости извлекали матку и определяли:

·  количество желтых тел в яичниках

·  общее количество плодов

·  общее количество имплантаций

·  количество живых и мертвых плодов

·  количество ранних или поздних резорбций

·  количество самок и самцов в помете

·  массу каждого плода

·  кранио-каудальный размер каждого плода

·  возможные внешние отклонения в развитии или наличие уродств у плодов

После визуального осмотра половину плодов из каждого помета помещали в 96о этанол и использовали для последующего изучения состояния скелета (окрашивание ализарином по методу Доусона в модификации НИИЭМ АМН СССР). Вторую половину плодов помещали в жидкость Буэна, для последующего изучения внутренних органов по методу Вильсона в модификации НИИЭМ АМН СССР.

Матки животных, в которых при вскрытии не выявлено плодов или различимых мест имплантации, извлекали и окрашивали по Салевски для визуализации возможных мест имплантации в случае полных ранних резорбций.

Статистическая оценка результатов вскрытия проводилась одним из методов непараметрического анализа – критерием U-Манна-Уитни, позволяющего сравнить две независимые выборки парных наблюдений и установить степень достоверности выявленных различий. Различия были определены при уровне доверительной вероятности 95%.

2.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В период введения препарата при клиническом наблюдении не было отмечено признаков какой-либо патологии у животных.

Динамика массы тела крыс в подопытных группах на протяжении беременности практически не отличалась от показателей контрольной (таблица 1). (При расчете средних показателей массы тела не учитывали массу тела самок, у которых при патологоанатомическом вскрытии не было установлено факта беременности).

Таблица 1

Масса тела крыс на протяжении беременности при внутримышечном введении субстанции фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат

Доза (мг/кг)	Кол-во беременных самок	Масса тела крыс в течение эксперимента, г
1 день	5 день	12 день	16 день	20 день
ДМСО	11	224,9±28,3	244,7±28,0	271,1±30,7	298,9±30,4	345,1±41,6
3,0	7	214,0±23,8	231,7±22,7	258,6±24,5	283,1±25,3	325,4±35,0
20,0	9	219,9±16,6	233,6±16,8	260,2±16,3	282,8±17,0	317,3±29,5

Результаты оценки показателей эмбриотоксического действия фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата приведены в табл. 2. При внешнем обследовании извлеченных плодов ни в одной из изучаемых групп не было обнаружено аномалий и пороков развития. Все плоды имели нормальное анатомическое строение.

Таблица 2

Результаты оценки эмбриотоксического субстанции фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат при внутримышечном введении крысам

Показатели	Доза (мг/кг)
ДМСО	3,0	20,0
Количество беременных самок	11	7	9
Количество эмбрионов	10,8±2,1	9,3±2,3	10,0±2,2
Результаты вскрытия (в расчете на одну самку)
Желтых тел	12,8±0,8	10,7±1,9	11,7±1,3
Мест имплантации	10,9±2,1	9,4±2,4	10,2±2,1
Живых плодов	10,8±2,1	9,3±2,3	10,0±2,2
Резорбированных плодов	0,1±0,1	0,1±0,1	0,2±0,2
Предимплантационная смертность, %	16,7±13,2	15,6±13,8	14,2±14,0
Постимплантационная смертность, %	1,0±1,0	1,6±1,1	2,9±2,4
Масса тела, г	3,4±0,6	3,8±0,2	3,7±0,1
Краниокаудальный размер, см	3,6±0,3	4,0±0,2	4,0±0,1
Количество в помете:	самок	5,0±2,3	4,0±2,8	5,6±2,1
самцов	5,8±3,3	5,3±1,6	5,0±2,2
Результаты внешнего осмотра плодов
Количество обследованных плодов	108	65	90
Количество плодов с аномалиями развития: общее / %	0/0	0/0	0/0
Результаты оценки состояния костной системы плодов
Количество обследованных плодов	52	32	47
Количество плодов с аномалиями развития: общее / %	10/19,2	7/21,9	9/19,1
Результаты оценки состояния внутренних органов плодов
Количество обследованных плодов	56	33	43
Количество плодов с аномалиями развития: общее / %	1/1,8	0/0	2/4,3

Как следует из представленных данных (табл.2), такие параметры оценки эмбриотоксического действия, как количество желтых тел в яичниках и число мест имплантации, а, следовательно, и предимплантационная смертность зародышей, статистически не отличались.