Методические рекомендации по применению набора реагентов для выявления РНК вируса Западного Нила в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенсÒ WNV-FL» Формат FRT (стр. 1 )

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

по применению набора реагентов

для выявления РНК вируса Западного Нила
в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

«АмплиСенсÒ WNV-FL»

Формат FRT

АмплиСенсÒ

Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии», Российская Федерация, город Москва, улица Новогиреевская, дом 3а

ОГЛАВЛЕНИЕ

НАЗНАЧЕНИЕ.. 3

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ.. 3

ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ ПРИБОРОВ Rotor-Gene 3000/6000 (Corbett Research, Австралия) и Rotor-Gene Q (Qiagen, Германия) 6

ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ ПРИБОРОВ iCycler iQ и iQ5 (Bio-Rad, США) 12

ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ ПРИБОРA Mx3000Р (Stratagene, США) 18

НАЗНАЧЕНИЕ

Методические рекомендации описывают порядок действий при использовании набора реагентов для выявления РНК вируса Западного Нила (WNV) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® WNV-FL» совместно с приборами для ПЦР в режиме «реального времени»: Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия); Rotor-Gene Q (Qiagen, Германия); iCycler iQ, iQ5 (Bio-Rad, США); Mx3000P (Stratagene, США) (см. табл. 1).

Таблица 1

Соответствие мишеней и каналов детекции

ПЦР-смесь-1	Детекция по каналу
FAM/Green	JOE/Yellow
ОТ-ПЦР-смесь-1-FRT WNV	ВКО	WNV

Соответствие названий флуорофоров и каналов детекции

Канал для флуорофора	Название канала детекции для разных моделей приборов[1]
Канал для флуорофора FAM	FAM/Green
Канал для флуорофора JOE	JOE/HEX/R6G/Yellow/Cy3

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

ВНИМАНИЕ! В соответствии с Директивой Европейского Союза 67/548/EEC следующие реагенты подлежат маркировке, как содержащие опасные вещества, а также требуют указания факторов риска (R) и мер предосторожности (S):

Наименование реагента	Наименование комплекта, в который входит реагент	Наименование опасного (в соответствии с директивой 67/548/EEC) вещества	Код опасности, перечень факторов риска (R) и мер предосторожности (S) в соответствии с директивой 67/548/EEC	по ГН 2.2.5.1313-03[2]
ПДК макс разовая/ среднесменная (мг/м3)	основная опасность	класс опасности	автоматический контроль над содержанием вещества в воздухе рабочей зоны
Раствор для лизиса	«РИБО-преп»	Гуанидин тиоцианат	Harmful[3] R:20/21//53 S:13-61	Нет данных
Лизирующий раствор	«РИБО-сорб»
Лизирующий раствор МАГНО-сорб	«МАГНО-сорб»
Раствор для отмывки 1	«РИБО-сорб»
Раствор для отмывки 5	«МАГНО-сорб»
Раствор D	«РИБО-золь-С»
Раствор для преципитации	«РИБО-преп»	Изопропанол	Highly flammable. Irritant3 R: S:7-16-24/25-26	50/10	Пары	Класс опасности 3	не требуется
Лизирующий раствор МАГНО-сорб	«МАГНО-сорб»
Раствор А	«РИБО-золь-С»	Фенол	Toxic, Corrosive R: 23/24//20/21/22-68 S: 24//37/39-45	1/ 0,3	Пары	Класс опас-ности 2	не требуется
Раствор В	«РИБО-золь-С»	Хлороформ	Harmful3 R: /20/22 S: 36/37	10/5	Пары	Класс опас-ности 2	не требуется
Раствор для отмывки 3	«РИБО-сорб», «РИБО-преп»	Этанол	Highly flammable3 R:11 S:7-16	2000/1000	Пары	Класс опасности 4	не требуется
Раствор для отмывки 4	«РИБО-сорб», «РИБО-преп»
Раствор для отмывки 5	«МАГНО-сорб»
Раствор для отмывки 6	«МАГНО-сорб»
Раствор для отмывки 7	«МАГНО-сорб»	Ацетон	Highly Flammable3 Irritant3 R: S:	800/ 200	Пары	Класс опас-ности 4	не требуется

Расшифровка обозначений факторов риска (R) и мер предосторожности (S).

R11: легко воспламеняется.

R20/21/22: опасен при проглатывании, контакте с кожей или вдыхании.

R22: опасен при проглатывании.

R23/24/25: ядовит при вдыхании, контакте с кожей и при проглатывании.

R32: при контакте с кислотой образует токсичный газ.

R34: вызывает ожоги.

R36: раздражает слизистую глаз.

R38: раздражает кожу.

R40: ограниченное число доказательств канцерогенного эффекта.

R48/20/22: опасность серьезного вреда для организма при длительном вдыхании и приеме внутрь.

R48/20/21/22: опасность серьезных повреждений организма при длительном вдыхании, контакте с кожей или при приеме внутрь

R52/53: опасен для водных организмов, может вызывать долговременное нежелательное воздействие на водную среду.

R66: при частых контактах может возникнуть сухость кожи и трещины.

R67: пары вещества могут вызывать сонливость и головокружение.

R68: риск необратимых последствий.

S2: держать в недоступном для детей месте.

S7: держать емкость плотно закрытой.

S9: держать контейнер в хорошо вентилируемом помещении.

S13: держать вдали от пищевых продуктов и напитков, продуктов для животных.

S16: держать вдали от источников огня, не курить.

S24/25: избегать контакта с кожей и глазами.

S25: избегать контакта с глазами.

S26: в случае попадания в глаза немедленно промыть большим количеством воды и обратиться за медицинской помощью.

S28: после попадания на кожу промыть большим количеством воды.

S36/37: использовать соответствующую защитную одежду и перчатки.

S36/37/39: использовать соответствующую защитную одежду, перчатки и маску/очки.

S37: использовать подходящие перчатки.

S45: в случае происшествия или ухудшения самочувствия немедленно обратиться за медицинской помощью.

S51: использовать только в хорошо вентилируемых помещениях.

S60: Данный материал и контейнер, в котором он хранился, должны утилизироваться в соответствии с правилами, предусмотренными для опасных отходов.

S61: избегать попадания в окружающую среду.

ВНИМАНИЕ! При работе с легковоспламеняющимися веществами соблюдать правила пожарной безопасности для учреждений здравоохранения ППБО 07-91 от 30.08.91.

ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ ПРИБОРОВ Rotor-Gene 3000/6000 (Corbett Research, Австралия) и Rotor-Gene Q (Qiagen, Германия)

Для работы с прибором Rotor-Gene 3000 следует использовать программу Rotor-Gene версии 6, с прибором Rotor-Gene 6000 – программу Rotor-Gene 6000 версии 1.7 (build 67) или выше.

Далее по тексту термины, соответствующие разным версиям приборов и программного обеспечения, указаны в следующем порядке: для англоязычной версии программы Rotor-Gene 3000 / для англоязычной версии программы Rotor-Gene 6000 / для русскоязычной версии программы Rotor-Gene 6000.

Провести этапы пробоподготовки и приготовления реакционных смесей согласно инструкции к набору реагентов. При работе с прибором Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000 и Rotor-Gene Q рекомендуется использование прозрачных ПЦР-пробирок на 0,2 мл с плоской крышкой (детекция через дно пробирки).

Поместить пробирки в ротор амплификатора Rotor-Gene 3000/6000/Q так, чтобы первая пробирка попала в лунку 1; установить ротор в прибор, закрыть крышку (ячейки ротора пронумерованы, эти номера используются в дальнейшем для программирования положения проб в амплификаторе).

Программирование амплификатора

1.  Нажать кнопку New/Новый в основном меню программы.

2.  В открывшемся окне выбрать шаблон запуска эксперимента Advanced/Детальный мастер и выделить Dual Labeled Probe/Hydrolysis probes/Флуоресцентные зонды (TaqMan). Нажать кнопку New/Новый.

3.  В открывшемся окне выбрать ротор на 36 лунок 36-Well Rotor/36-луночный ротор и отметить, что вы не используете пробирки с круглыми крышками (Rotor-Gene 3000)/закреплено фиксирующее кольцо (Rotor-Gene 6000). Нажать кнопку Next/Далее.

4.  В открывшемся окне задать оператора и выбрать объем реакционной смеси: Reaction volume/Объем реакции – 25 мкл. Для прибора Rotor-Gene 6000 установить галочку напротив функции 15 µl oil layer volume/15 μL объем масла/воска. Нажать кнопку Next/Далее.

5.  В открывшемся окне необходимо задать температурный профиль эксперимента. Для этого нажать кнопку Edit profile/Редактор профиля и задать следующие параметры (см. табл. 2).

Таблица 2

Программа амплификации для приборов роторного типа

Цикл	Температура, °С	Время	Измерение флуоресценции	Количество циклов
1	50	30 мин	–	1
2	95	15 мин	–	1
3	95	5 с	–	5
56	25 с	–
72	15 с	–
4	95	5 с	–	40
56	25 с	FAM/Green, JOE/Yellow
72	15 с	–

6.  После того как выбран температурный профиль эксперимента, нажать кнопку OK/Да.

7.  В окне New Run Wizard/Мастер Нового Теста нажать кнопку Calibrate/Gain Optimisation…/Опт. уровня сигн.

-  осуществлять калибровку по каналам FAM/Green и JOE/Yellow (нажать кнопку Calibrate Acquiring/Optimise Acquiring/Опт. Детек-мых);

-  осуществлять калибрование по каналам FAM/Green, JOE/Yellow перед первым измерением (активировать Perform Calibration Before 1st Acquisition/ Perform Optimisation Before 1st Acquisition/ Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции);

-  установить калибровки канала FAM/Green по первой пробирке и от 5Fl до 10Fl, канала JOE/Yellow – от 5Fl до 10Fl (активировать Edit…/Правка…, окно Auto gain calibration channel settings/Авто-оптимизация уровня сигнала).

8.  Нажать кнопку Next/Далее, запустить амплификацию кнопкой Start run/Старт.

9.  Дать название эксперименту и сохранить его на диске (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента).

10. Внести данные в таблицу образцов (открывается автоматически после запуска амплификации). В колонке Name/Имя указать названия/номера исследуемых и контрольных образцов. Для пустых ячеек установить тип None/Пусто.

ВНИМАНИЕ! При установке типа None/Пусто данные образца анализироваться не будут!

Анализ результатов

Результаты анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени». Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов.

Анализ результатов амплификации по каналу FAM/Green

1.  Активировать нажатием в меню кнопки Analysis/Анализ, выбрать режим анализа Quantitation/Количественный, активировать кнопку Cycling A. FAM/Cycling A. Green, Show/Показать.