Выделение, изучение и использование перспективных штаммов ассоциативных ризобактерий в РСО-алания (стр. 3 )

– отсутствие роста

3.1.7. Идентификация и депонирование перспективных штаммов PGPR

По данным лабораторных тестов из 30 штаммов было отобрано несколько перспективных. После оценки их эффективности в полевых опытах с озимой пшеницей и другими сельскохозяйственными культурами три высокоэффективных штамма было идентифицировано методом секвенирования 16S rRNA как Pseudomonas fluorescens штамм 17-1; Sphingomonas spiritivorum штамм 38-22 и Xanthomonas sp. штамм 33-3.

Эти штаммы были депонированы во Всероссийской государственной коллекции непатогенных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (CIAM) ГНУ Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург) под следующими регистрационными номерами:

«ВНИИСХМ 622Д» – Pseudomonas fluorescens штамм 17-1 – изолирован из ризопланы ячменя заячьего, депонирован как ростстимулирующий, высокоэффективный при инокуляции семян и обработке вегетирующих растений зерновых культур, а также обладающий высокой антифунгальной активностью по отношению к фитопатогенным грибам;

«ВНИИСХМ 620Д» – Sphingomonas spiritivorum штамм 38-22 – изолирован из ризопланы ячменя заячьего, депонирован как ростстимулирующий, активно продуцирующий ИУК, высокоэффективный при инокуляции семян и обработке вегетирующих растений зерновых и кормовых культур;

«ВНИИСХМ 621Д» – Xanthomonas sp. штамм 33-3 – изолирован из ризопланы полевицы, депонирован как ростстимулирующий, высокоэффективный при инокуляции семян и обработке вегетирующих растений зерновых культур.

3.1.8. Группировка выделенных штаммов ризобактерий

Нами проведены тесты по изучению влияния штаммов с различными свойствами на рост проростков и корней при инокуляции семян высших растений (кресс-салата, брюквы столовой и озимой пшеницы). Полученные данные свидетельствуют о различном воздействии разных штаммов на рост и развитие сельскохозяйственных культур.

Анализ данных по изучению качеств, присущих выделенных нами PGPR штаммов, позволяет разделить их по биохимической активности на 3 основные группы (табл. 6):

1. Бактерии-стимуляторы роста растений – штаммы-продуценты биологически активных веществ ростовой природы, стимулирующие рост хлореллы и способствующие удлинению проростков и корней растений не менее чем на 15% относительно контрольного варианта: 11-41, 26-44, 32-32, 33-3, 36-6, 38-22.

2. Биоконтрольные агенты – штаммы-антагонисты, активно подавляющие один или несколько фитопатогенов, но при этом существенно не ингибирующие рост растений. Бактериальные штаммы 11-12, 17-1 и 18-5 обладают высокой антифунгальной активностью, широким спектром действия и в разведении 1:100 и 1:1000 мало влияют на рост растений.

3. Бактерии комплексного действия – штаммы комплексного действия с сочетанием средних уровней антифунгальной и ростстимулирующей активности. К таким штаммам относятся 25-5 и 39-13, которые стимулировали рост инокулированных растений от 20 до 50% относительно контроля и подавляли один или несколько фитопатогенных грибов, таких как F. graminearum, F. oxysporum, F. solani, Sclerotinia libozi, R. solani, Penicillium sp., Macrosporium sp.

Таблица 6. Реакция культурных растений на PGPR штаммы

n=15…20

Штамм	Кресс-салат	Брюква столовая	Пшеница
ростстимулирующие штаммы
11-41	+	+	-
26-44	+	-	+
32-32	+	+	+
33-3	+	-	+
36-6	-	+	+
38-22	+	+	+
биоконтрольные штаммы
11-12	+	-	+
17-1	+	+	+
18-5	+	+	-
штаммы комплексного действия
25-5	+	+	+
39-13	+	+	+
67-91	+	-	-

Примечание: + положительная реакция; – отрицательная реакция

Лабораторные тесты позволили оценить возможность применения этих штаммов на культурных растениях: кресс-салате, брюкве столовой и пшенице. Так, например, кресс-салат хорошо отзывался на бактеризацию всеми перечисленными штаммами, за исключением штамма 36-6. Брюква столовая и озимая пшеница тоже отзывчивы на инокуляцию штаммами PGPR, однако при выращивании брюквы, возможно, следует отказаться от применения штаммов 26-44, 33-3, 67-91 и 11-12, а при возделывании пшеницы – от 11-41, 18-5 и 67-91, так как рост этих растений в определенной степени угнетался бактериальными метаболитами. Кроме того, следует отметить, что штаммы 32-32, 38-22, 17-1, 25-5 и 39-13 улучшали рост всех указанных культур.

3.2. Определение эффективности перспективных PGPR штаммов

3.2.1. Биологическая эффективность PGPR штаммов против болезней озимой пшеницы

В полевых опытах с озимой пшеницей самую высокую биологическую эффективность против мучнистой росы имели варианты с обработкой штаммом 1,3%), 1,6%); флавобактерином (54,2%) и ризоагрином (47,7%) (рис. 1). Меньшую биологическую эффективность показали штаммы 38,5%), В-,7%) и штамм 26,6%). На других вариантах, где применялись штаммы 36-6, 33-3, 39-13, 25-5 и 31-3, биологическая эффективность была значительно ниже. Здесь она в разные годы колебалась от 16,0 до 32,3%. Следует отметить и то, что вариант N45 имел отрицательные показатели биологической эффективности (–9,4%). По-видимому, внесение азотных удобрений (N45) стимулирует развитие мучнистой росы на посевах озимой пшеницы.

Рисунок 1. Биологическая эффективность PGPR штаммов против болезней

озимой пшеницы, в среднем за гг.

Против септориоза на флаговых листьях самые высокие показатели биологической эффективности имели варианты с применением PGPR штаммов: 17-1, 18-5, флавобактерина и ризоагрина – 71,9%, 67,2%, 64,6% и 59,7% соответственно по сравнению с контрольным вариантом. Средний уровень биологической эффективности показали штаммы 38,4%), 3,4%) и 26,3%). На вариантах с применением штаммов В-335, 36-6, 25-5, 39-13 и 31-3 биологическая эффективность была значительно ниже и составила 31,3, 31,1, 18,7, 20,5 и 11,9% соответственно.

Внесение азотных удобрений (N45) также снижало устойчивость растений озимой пшеницы к септориозу, но значительно (в 2,3 раза) меньше, чем к мучнистой росе.

Наибольшая биологическая эффективность штаммов PGPR против возбудителей фузариоза колоса озимой пшеницы была на варианте с применением штамма 17-1 – 83,0%. Варианты с применением штаммов 18-5, флавобактерина, ризоагрина, 38-22 и 26-44 имели несколько меньшую биологическую эффективность, но все же значительно сдерживали развитие фузариоза колоса. Биологическая эффективность их составляла 71,8%, 67,8%, 55,2%, 54,8% и 45,3% соответственно. На вариантах с применением штаммов В-335, 31-3, 36-6, 39-13, 33-3 и 25-5 биологическая эффективность была на уровне 13,6 – 33,5%.

На развитие фитопатогенов существенное влияние оказывали климатические условия конкретного года исследований. Так, внесение азотных удобрений (N45) провоцировало развитие фузариоза колоса сильнее в холодном и с большим количеством осадков 2004 году, чем в относительно сухие и теплые 2005 – 2006 годы.

В заключение следует отметить, что биологическая эффективность, как результат взаимодействия всех трех звеньев простейшей биологической системы триотрофа – PGPR-растение-фитопатоген, в значительной степени отражает степень воздействия ризосферных бактерий на растение и патоген, и наоборот. По результатам трехлетних исследований высокую фунгистатическую активность против мучнистой росы, септориоза и фузариоза колоса показали варианты с применением штаммов 17-1, 18-5, флавобактерина и ризоагрина. Несколько меньшую биологическую эффективность имели варианты с применением штаммов 38-22, 26-44 и В-335. Остальные ризобактерии имели низкую биологическую эффективность. Биоконтрольная активность изучаемых штаммов в разные по климатическим условиям годы характеризовалась различной эффективностью. Установлено также, что внесение азотных удобрений (вариант N45) провоцирует развитие септориоза и фузариоза колоса по сравнению с контрольным вариантом.

3.2.2. Влияние бактериальных препаратов на урожайность озимой пшеницы

Было установлено, что урожайность озимой пшеницы широко варьировала по годам исследований и по вариантам опыта. Так, в 2004 году она колебалась от 2,27 т/га в контроле до 3,03 т/га (НСР05 - 0,22) на варианте N45, в 2005 году от 3,71 до 4,79 т/га (НСР05 - 0,51) на тех же вариантах и в 2006 году от 2,76 до 3,47 т/га на 8 варианте (штамм 26-44) (НСР05 - 0,45) (табл. 7). Следовательно, наименьший урожай по всем вариантам опыта был получен в 2004 году, наибольший – в 2005 году. Это можно объяснить влиянием температуры и количеством выпавших осадков.

2004 год по количеству выпавших осадков был самым влажным, но температурные условия, сложившиеся осенью 2003 года и весной 2004 года были неблагоприятные. Отклонения температуры от многолетней нормы составили +2,2 - +3,3оС. Кроме того, в мае 2004 года выпало осадков всего 42,2% от многолетней нормы и острозасушливые условия в этот период отрицательно повлияли на урожайность озимой пшеницы по всем вариантам опыта. Несмотря на это, в 2004 году по всем вариантам опыта, кроме 8 (26-44), получены достоверные прибавки урожая. Наибольшими они были на вариантах 2 (N45), 8 (В-335) и 6 (17-1) – 0,76; 0,29 и 0,27 т/га соответственно, а наименьшими на вариантах 8 (26-44); 7 (18-5) и 9 (38-22) – 0,15; 0,22 и 0,24 т/га соответственно. Следует отметить, что 2 вариант (N45) по прибавке урожая превосходил все остальные варианты достоверно. Применение бактериальных препаратов дало прибавку урожая от 0,22 до 0,29 т/га, но по эффективности между собой эти препараты достоверно не различались.

В 2005 году по урожайности сложилась аналогичная 2004 году ситуация: по всем вариантам опыта она была значительно выше. В то же время по урожайности варианты 2 (N45) и 5 (В-335) сравнялись, прибавки составили 1,08 и 0,95 т/га (НСР05 - 0,51), то есть разница между ними в пределах ошибки опыта. Внесение азотных удобрений (N45) по своей эффективности превосходил только 3 вариант (ризоагрин). Прибавки варианта 2 (N45) и вариантов с применением бактериальных удобрений достоверно одинаковые.

По средним данным трех лет исследований наибольшую прибавку дало внесение азотных удобрений (N45) – 0,84 т/га, довольно высокие прибавки получены при применении бактериальных препаратов В-335, 38-22, 26-44, 18-5, 17-1 – 0,65; 0,58; 0,59; 0,47 и 0,44 т/га соответственно.

Таблица 7. Влияние бактериальных препаратов на урожайность озимой пшеницы

Варианты	2004 г.	2005 г.	2006 г.	Среднее
урожайность, т/га	прибавка	урожайность, т/га	прибавка	урожайность, т/га	прибавка	урожайность, т/га	прибавка
т/га	%	т/га	%	т/га	%	т/га	%
1. контроль	2,27	0	0	3,71	0	0	2,76	0	0	2,91	0	0
2. N45	3,03	0,76	33,5	4,79	1,08	29,1	3,44	0,68	24,6	3,75	0,84	28,9
3. ризоагрин	2,49	0,22	9,7	4,00	0,29	7,8	3,21	0,45	16,3	3,23	0,32	11,0
4. флавобактерин	2,53	0,26	11,5	-	-	-	3,18	0,42	15,2	2,86	0,34	13,5
5. В-335	2,56	0,29	12,8	4,66	0,95	25,6	3,45	0,69	25,0	3,56	0,65	22,3
6. 17-1	2,54	0,27	11,9	4,29	0,58	15,6	3,22	0,46	16,7	3,35	0,44	15,1
7. 18-5	2,49	0,22	9,7	4,42	0,71	19,1	3,23	0,47	17,0	3,38	0,47	16,2
8. 26-44	2,42	0,15	6,6	4,60	0,89	24,0	3,47	0,71	25,7	3,50	0,59	20,3
9. 38-22	2,51	0,24	10,6	4,64	0,93	25,1	3,33	0,57	20,7	3,49	0,58	19,9
	-	-	-	-	-	-	3,26	0,50	18,1	3,26	0,50	18,1
	-	-	-	4,44	0,73	19,7	3,14	0,38	13,8	3,79	0,55	17,0
	-	-	-	4,21	0,50	13,5	-	-	-	4,21	0,50	13,5
	2,72	0,45	19,8	4,14	0,43	11,6	-	-	-	3,43	0,44	14,7
	2,33	0,06	2,6	-	-	-	-	-	-	2,33	0,06	2,6
	HCP05 =0,22			HCP05 =0,51			HCP05 =0,45

Следовательно, все применяемые бактериальные препараты по сравнению с контрольным вариантом были высокоэффективны при возделывании озимой пшеницы и незначительно уступали по эффективности варианту с внесением азотных удобрений (N45).

3.3. Использование новых микробных препаратов для повышения

продуктивности бобовых культур

Горох. Предпосевная обработка семян и вегетирующих растений гороха микробными препаратами штаммов 17-1, 38-22, а также их смесью повысила устойчивость растений к болезням, при этом формировался более мощный симбиотический аппарат, количество фиксированного азота воздуха повышалось с 44 кг/га до 67,3 кг/га, что способствовало повышению урожайности гороха до 3,2 т/га. Прибавки урожая составили 0,17 - 0,38 т/га.

Соя. Обработка семян и вегетирующих растений сои микробными препаратами повышала их устойчивость к болезням и способствовала получению стабильных экологически чистых урожаев. При этом наиболее эффективной являлась обработка семян и вегетирующих растений штаммом 17-1 и смесью штаммов 17-1+38-22, что позволило получить прибавки урожая от 0,14 до 0,40 т/га.

Клевер. Микробные препараты при инокуляции семян клевера перед посевом и опрыскивании вегетирующих растений проявили различную эффективность на разных сортах. Наиболее отзывчивым на бактеризацию оказался сорт Владикавказский, прибавки зеленой массы на обработанных вариантах составили: 2,67-4,76 т/га или 2,58-4,60%.

Люпин. Инокуляция семян люпина перед посевом жидкими препаратами ризосферных бактерий оказывала определенное влияние на формирование симбиотического аппарата люпина. Так, инокуляция люпина сорта Деснянский штаммом 38-22 увеличивала количество клубеньков на одном растении в фазу цветения в 1,8 раза, штаммом 18-5 – в 1,5 раза, а штаммом 33-3 – в 1,2 раза. Биопрепараты оказали влияние и на величину массы клубеньков на одном растении. В фазу цветения на вариантах с применением штаммов 38-22, 18-5 и 33-3 – она увеличилась в 2,8, 1,8 и 1,3 раза, соответственно.

Козлятник восточный. Применение микробных препаратов при возделывании козлятника восточного повышает устойчивость растений к болезням. Так, препараты штаммов 38-22 и 17-1 при их совместном применении на фоне инокуляции значительно повышали устойчивость растений козлятника восточного к болезням – биологическая эффективность составляла 90% и более.

Кроме того, применение микробных препаратов 17-1 и 38-22 на фоне ризоторфина для предпосевной обработки семян и вегетирующих растений обеспечило прибавку урожая зеленой массы от 6,6 до 18,1 т/га. Максимальная урожайность была получена при двукратной обработке смесью микробных препаратов 17-1 + 38-22 на фоне ризоторфина – 68,2 т/га, прибавка составила 36,1%.

3.4. Экономическая эффективность применения микробных препаратов при возделывании озимой пшеницы

При расчете экономической эффективности возделывания озимой пшеницы с применением микробных препаратов было установлено, что чистый доход от применения бактериальных препаратов колебался от 980 (ризоагрин) до 2250 руб./га (штамм 38-22). Наибольшим он был при применении препаратов штамма 38-22 – 2250 руб./га и В-335 – 2090 руб./га, наименьшим – при применении ризоагрина – 980 руб. и флавобактерина 1100 руб./га. Чистый доход от применения азотных удобрений составил 3376 руб./га.

Рентабельность применения азотных удобрений (N45) составила 203%, а применения новых микробных препаратов 17-1 и 18-5 – 201% и 200% соответственно.

Рентабельность варианта с применением азотных удобрений (N45) незначительно превышает рентабельность вариантов с применением новых микробных препаратов 17-1, 18-5 и 38-22. Однако учитывая экологичность этих препаратов, считаем их применение при возделывании озимой пшеницы более предпочтительным.

Кроме того, следует иметь в виду и тот факт, что при увеличении урожайности озимой пшеницы от внесения минеральных и бактериальных удобрений на 1 тонну с 1 гектара, на столько же или больше увеличивается количество корневых и пожнивных остатков, что по агрономической ценности соответствует дополнительному внесению 4 т/га полуперепревшего навоза и способствует стабилизации, а в некоторых случаях и повышению плодородия почвы.

Выводы

1. Из ризосферы дикорастущих злаков, произрастающих в условиях вертикальной зональности Северного Кавказа, выделены и изучены 30 перспективных штаммов PGPR.

2. Выделенные штаммы обладают фитостимулирующей способностью и стимулируют рост хлореллы (штаммы 11-15, 11-16, 11-91, 26-44, 31-31, 31-32 и 33-3), озимой пшеницы (штаммы 11-41, 39-13, 11-12, 26-44, 32-32, 33-3 и 38-22), брюквы столовой (штаммы 11-41, 25-5, 39-13, 38-22, 36-6, 17-1 и 32-32), кресс-салата (штаммы 11-41, 39-13, 11-12, 26-44, 32-32 и 38-22).

3. Максимальную антифунгальную активность по отношению к фитопатогенным грибам проявляли штаммы 11-12, 17-1 и 18-5.

4. Наибольшее количество индолил-3-уксусной кислоты продуцировали штаммы 11-15, 11-42, 26-44, 31-33, 32-32, 36-6, 38-22, 67-91 – до 200 мкг/мл.

5. Наибольшей азотфиксирующей активностью характеризовались штаммы 17-1, 11-12, 11-14, 26-44, 31-32, 31-31, 38-21.

6. Высокую устойчивость к средним (100µМ) и высоким (1000µМ) концентрациям кадмия в среде проявило около половины изученных штаммов. К средним концентрациям кобальта (100µМ) наиболее устойчив был штамм 11-41; штаммы 11-12, 36-42, 26-43б, 26-43ж, 26-44, 39-13 и 67-91 характеризовались меньшей устойчивостью. К высоким концентрациям кобальта оказались чувствительны все изученные штаммы.

7. Из отобранных и изученных 30 перспективных PGPR штаммов идентифицированы и депонированы во Всероссийской государственной коллекции непатогенных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (CIAM) ГНУ Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург) 3 штамма: Pseudomonas fluorescens 17-1 (обладает высокой супрессирующей активностью к фитопатогенным грибам), Sphingomonas sp. (Flavobacterium) 38-22 (стимулятор роста растений, продуцирует большое количество ИУК), Xanthomonas sp. 33-3 (стимулятор роста растений, синтезирует неидентифицированные вещества с ростстимулирующей активностью и небольшое количество ИУК).

8. Применение новых микробных препаратов – штаммов 17-1, 18-5 и 38-22 снижало распространение и степень развития: мучнистой росы на 40,9 и 11,4%, 35,2 и 9,2%, 25,0 и 6,3% соответственно; септориоза – на 40,8 и 12,7%, 38,1 и 11,8%, 28,1 и 8,8% соответственно; фузариоза колоса – на 9,1 и 3,9%, 6,8 и 3,2%, 4,2 и 2,1% соответственно.

9. Применяемые бактериальные препараты были эффективны при возделывании озимой пшеницы и незначительно уступали по эффективности варианту с внесением азотных удобрений (N45).

10. Высокие прибавки урожая были получены при применении бактериальных препаратов 38-22, 18-5, 17-1 – 0,58 т/га или 19,9%; 0,47 т/га или 16,2% и 0,44 т/га или 15,1% соответственно.

11. Применение бактериальных препаратов 17-1, 38-22 и их смесей повышало болезнеустойчивость, азотфиксирующую активность и продуктивность: гороха (прибавки урожая составили 0,17-0,38 т/га) сои (0,14-0,4 т/га) и клевера (2,58-4,76 т/га).

Предложения производству

1. На основе вновь выделенных перспективных штаммов PGPR рекомендуем для растениеводства производить бактериальные препараты, адаптированные к природным условиям Северного Кавказа.

2. Для повышения продуктивности озимой пшеницы, получения экологически чистого урожая 3,5 т/га следует в фазу кущения-выхода в трубку обрабатывать вегетирующие растения бактериальными препаратами (штаммы 38-22, 18-5 и 17-1) в дозе 2 л/га (400 л/га раствора).

3. Для повышения продуктивности бобовых культур и получения экологически чистых урожаев: гороха – 3,2 т/га и сои – 2,3 т/га следует семена перед посевом инокулировать смесью штаммов 17-1 и 38-22 дозой 300 мл на гектарную норму семян и опрыскивать вегетирующие растения в фазу начала бутонизации дозой 2 л/га (400 л/га раствора).

Список опубликованных работ по материалам диссертации

Публикации в рецензируемых изданиях, рекомендованных

ВАК Минобрнауки РФ:

1.  Пухаев новых штаммов ассоциативных ризобактерий на посевах озимой пшеницы. / , , // Земледелие. – 2009. – № 8 – С. 40-41.

2.  Фарниев продуктивность сои при использовании микробных препаратов. / , , // Кормопроизводство. – 2010. – № 11 – С. 6-9.

3.  АЦК-дезаминазная активность PGPR штаммов и их устойчивость к тяжелым металлам. / , , // Известия ФГОУ ВПО «ГГАУ». – 2011. - Часть 1. – Т. 48 – С. 65-68.

4.  , Пухаев эффективность PGPR штаммов против болезней озимой пшеницы. / , // Известия ФГОУ ВПО «ГГАУ». – 2012. - Часть 1-2. – Т. 49 – С. 80-84.

Публикации в других изданиях:

5.  Пухаев и изучение перспективных ассоциативных ризобактерий из разных природных зон РСО-А для инокуляции сельскохозяйственных культур. / , , // В кн. «Герценовские чтения», факультет биологии РГПУ им. . – 2005. – С.-Пб., – С. 29-30.

6.  Пухаев эффективности почвоудобрительных биопрепаратов на основе производственных и экспериментальных штаммов ризосферных бактерий на посевах озимой пшеницы в условиях лесостепи РСО-А. / , , // Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы применения удобрений в сельском хозяйстве». – 2006. – Владикавказ. – С. 161-163.

7.  Фарниев биопрепаратов на рост, развитие и урожайность озимой пшеницы. / , , // Материалы IV Международной конференции «Актуальные и новые направления сельскохозяйственной науки». – 2008. – Владикавказ. – С. 25-26.

8.  Пухаев PGPR-штаммы как основа для создания биопрепаратов. / , // Материалы IV Международной конференции «Актуальные и новые направления сельскохозяйственной науки». – 2008. – Владикавказ. – С. 145-146.

9.  К теоретическим вопросам использования PGPR в практике сельского хозяйства / // Известия ФГОУ ВПО «ГГАУ». – 2008. часть 2. – том 45 – С. 11-14.

10.  Пухаев фитостимулирующей активности ассоциативных PGPR штаммов. / // Материалы Международной конференции «Молодые ученые Агропромышленному комплексу». – 2008. - Владикавказ. – С. 14-15.

11.  Фарниев применения микробных биопрепаратов на посевах сои. / , , // Труды Всероссиской научно-производственной конференции «Новые направления в решении проблем АПК на основе современных ресурсосберегающих технологий». – 2010. – Владикавказ. – С. 13-14.

12.  Фарниев микробных препаратов в повышении продуктивности гороха. / , , //Материалы Международной научно-технической конференции «Новые направления в решении проблем АПК на основе современных ресурсосберегающих инновационных технологий». – 2011. – Часть. 2. – Владикавказ. – С. 68-70.

13.  Сабанова микробных препаратов в повышении плодородия почв и продуктивности козлятника восточного. / , , // Материалы VII Международной конференции молодых ученых «Актуальные и новые направления сельскохозяйственной науки». – 2011. – Владикавказ. – С. 166-168

14.  , Фарниев биологической защиты картофеля. Патент РФ № 000. / , Фарниев Д. И. // - 2008.