Выделение, изучение и использование перспективных штаммов ассоциативных ризобактерий в РСО-алания (стр. 1 )

На правах рукописи

Пухаев Андрей Робертович

ВЫДЕЛЕНИЕ, ИЗУЧЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ШТАММОВ АССОЦИАТИВНЫХ РИЗОБАКТЕРИЙ

в РСО-алания

03.02.14 – биологические ресурсы

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата сельскохозяйственных наук

Владикавказ – 2012

Работа выполнена на кафедре агроэкологии и защиты растений ФГБОУ ВПО

«Горский государственный аграрный университет».

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор

Фарниев Александр Тимофеевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

кандидат биологических наук, доцент

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Северо-Кавказская государственная

гуманитарно-техноллгическая академия»

Защита диссертации состоится 05 мая 2012 г. в 13 ч. на заседании диссертационного совета Д 220.023.04 при ФГБОУ ВПО «Горский государственный аграрный университет» РСО-Алания, 7, Горский ГАУ, зал заседаний диссертационного совета. Тел./; E-mail: *****@***ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Горский государственный аграрный университет», с авторефератом на официальном сайте www. *****

Текст объявления о защите диссертации и автореферат диссертации отправлены в Минобрнауки РФ по адресам: ***** и *****@ 04 апреля 2012 г.

Автореферат диссертации разослан 05 апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук, доцент

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение вопросов биоразнообразия, экологии ризосферных бактерий, принципов взаимодействия с растениями-макросимбионтами и механизмов стимуляции роста растений является важной проблемой. Проведение таких исследований позволит создавать новые микробные препараты для разных природно-климатических условий с определенными свойствами, прогнозировать эффективность их применения, поможет более точно выявить роль бактериальных препаратов в повышении продуктивности агрофитоценозов.

Известно, что эффективность препаратов на основе ассоциативных ризобактерий значительно меняется в зависимости от почвенно-климатических условий места их применения. Поэтому следует ставить вопрос о перспективе «зонального подхода» в разработке биопрепаратов, который подразумевает при их создании использование в качестве основы эффективных аборигенных штаммов PGPR (от Plant Growth-Promoting Rhizobacteria – ризосферные бактерии, способствующие росту растений), изолированных в данной местности и адаптированных к природным условиям этой природной зоны.

Цель и задачи исследований. Целью исследований было выделение ассоциативных ризобактерий из ризосферы злаковых трав различных природных зон РСО-Алания, их изучение, отбор перспективных штаммов, создание на их основе микробных препаратов, адаптированных к различным агроклиматическим условиям, и определение эффективности их применения в растениеводстве.

В задачи исследований входило:

- сбор и выделение ассоциативных бактерий из ризосферы злаковых трав разных природных зон РСО-Алания;

- изучение и отбор перспективных штаммов ассоциативных ризобактерий;

- определение в лабораторных условиях ростстимулирующей, фунгистатической, фосфатмобилизующей, азотфиксирующей активности и других свойств воздействия PGPR на растения;

- идентификация и депонирование перспективных штаммов PGPR;

- создание микробных препаратов на основе отобранных штаммов;

- определение эффективности применения новых бактериальных препаратов в растениеводстве.

Научная новизна исследований состоит в том, что впервые в условиях вертикальной зональности из ризосферы диких злаков, произрастающих в разных природных зонах РСО-Алания, изолированы и отобраны перспективные штаммы PGPR, изучены их свойства, созданы на их основе новые микробные препараты и определена эффективность их применения в растениеводстве.

Основные научные положения, выносимые на защиту:

1.  Аборигенные штаммы ассоциативных ризобактерий.

2.  Свойства новых перспективных штаммов PGPR.

3.  Идентификация и депонирование штаммов PGPR.

4.  Эффективность применения новых бактериальных препаратов в растениеводстве.

Практическая значимость исследований заключается в том, что созданные новые микробные препараты – штамм 17-1, штамм 38-22, штамм 33-3, адаптированные к природным условиям Северного Кавказа, улучшают рост и развитие, повышают болезнеустойчивость и продуктивность культурных растений: озимой пшеницы на 10-20%, зерновых бобовых культур на 15-20%, многолетних бобовых трав на 30-40%.

Представленная работа является составной частью плана научно-исследовательских работ Горского государственного аграрного университета (№ 01.2. и 01.2.).

Реализация результатов исследований. Депонированные перспективные штаммы PGPR и препараты на их основе испытываются в Географической сети опытов Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург), а также используются в научно-исследовательской работе аспирантов и студентов ФГБОУ ВПО «Горский ГАУ» (г. Владикавказ).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и одобрены на:

- двух выставках: «Выставка достижений молодых ученых РСО-Алания», организованная Минмолодежи РСО-А и Советом молодых ученых и специалистов при Главе РСО-А, г. Владикавказ, 30.03.2010 г.; «Межвузовская выставка работ молодых ученых РСО-А», организованная Партией «Единая Россия» и ФГБОУ «Горский ГАУ», г. Владикавказ, 16.07.2011 г.

- заседаниях кафедры агроэкологии и защиты растений ФГБОУ ВПО «Горский ГАУ», г. Владикавказ, 2003 – 2011 гг. и заседаниях лаборатории экологии ризосферных микроорганизмов ВНИИСХМ, г. Санкт-Петербург, 2003 – 2004 гг.;

- семи международных научных конференциях (Владикавказ, , 2011 гг., Краснодар, 2009 г.) и одной всероссийской конференции (Владикавказ, 20011 г.);

- ежегодных Итоговых научно-практических конференциях в ФГБОУ ВПО «Горский ГАУ», г. Владикавказ, 2008 – 2011 гг.

Результаты исследований подтверждены патентом РФ № 000 «Способ биологической защиты растений», получено 2 решения о выдаче патента № /10 «Способ биологической защиты и повышения продуктивности озимой пшеницы» и № /10 «Способ защиты озимых зерновых культур от корневых гнилей и карликовой ржавчины».

По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 4 в изданиях рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, получен 1 патент на изобретение.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 191 странице компьютерного набора и состоит из введения, 6 глав, выводов и предложений производству. Работа иллюстрирована 36 таблицами, 17 рисунками. Список литературы включает 336 источников, в том числе 197 иностранных авторов.

Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории экологии симбиотических и ассоциативных ризобактерий ВНИИСХМ: зав. лаб. к. б.н. , к. б.н. и д. б.н. за методическую помощь и предоставленную возможность проведения лабораторных исследований.

2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность поиска и изучения ассоциативных ризосферных бактерий стимулирующих рост растений (PGPR) в разных природных условиях РСО-Алания, сформулированы научная новизна, практическая значимость и основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы приведены сведения о свойствах ризосферных бактерий, влиянии на них абиотических и биотических факторов внешней среды, механизмах взаимодействия с растением-макросимбионтом и фитопатогенными микроорганизмами. Показаны возможность и особенности практического использования эффективных штаммов PGPR и эффективность применения биопрепаратов на их основе в растениеводстве.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований были ризосферные бактерии, выделенные с корней дикорастущих злаков: пырея ползучего (Elytrigia repens L.), полевицы (Agrostis sp.), ячменя заячьего (Hordeum leporium L.), костра (Bromus sp.), тимофеевки (Phleum sp.), ежи сборной (Dactylis glomerata L.).

Изоляцию ризобактериальных сообществ проводили в гг. из ризопланы злаковых трав, собранных в фазе цветения-колошения в засушливой и умеренно засушливой подзонах равнинной зоны, в подзонах достаточного и повышенного увлажнения предгорной зоны, горно-лесном, субальпийском и альпийском поясах горной зоны РСО-Алания.

Накопительные культуры диазотрофных ризобактерий получали высевом гомогената отмытых корней в полужидкую модифицированную безазотную среду Доберейнер - DN (Barber et al., 1976). Выделение, очистку и поддержание чистых культур проводили на твердой среде ДАС ( и др., 1985).

В качестве эталонных штаммов в различных тестах использовали промышленные штаммы ВНИИСХМ: Flavobacterium sp. L-30-II-1, Azospirillum lipoferum 137, Pseudomonas putida Bm3, Alkaligenes xylosoxidans Cm3 и Pseudomonas sp. ПГ-5.

Ростстимулирующую активность изолятов изучали модифицированным методом точечного тестирования на твердой среде БиНИИ (, 1983) с тест-объектом водорослью Chlorella vulgaris 157.

Фунгистатическую активность определяли методом лунок (, 1983) на среде Чапека для микроскопических грибов (Й. Сэги, 1983).

Способность бактерий продуцировать биологически активные вещества и токсины определяли методом замачивания семян по (1966).

Фосфатрастворяющую активность изучали на среде Пиковской (Johri et al, 1999) с 1,7% агара и добавлением 0,15% свежеосажденного ортофосфата кальция по методу Геттерсона в модификации Муромцева (, 1991).

Способность штаммов продуцировать индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) оценивали инкубированием стационарно в течение 6 суток в жидкой среде DAS с добавлением 0,05% L-триптофана. Количество ИУК определяли колориметрически с реактивом Сальковского (Patten, Glick, 2002).

Азотфиксирующую (нитрогеназную) активность определяли методом редукции ацетилена на газовом хроматографе во флаконах с полужидкой средой DN с яблочной кислотой и введением ацетилена 10% от газовой фазы.

АЦК-дезаминазную активность изучаемых ризобактерий определяли по их способности использовать АЦК в качестве единственного источника азота на агаризованной среде ДАС.

Устойчивость к тяжелым металлам (Cd и Co) определяли на твердой среде ДАС с усиленным в 10 раз фосфатным буфером и содержащей 10 µМ, 100 µМ и 1000 µМ кадмия и кобальта.

Полевые опыты ( гг.) с озимой пшеницей сорта Уманка проводили в АО «Ногир» на выщелоченных черноземах в соответствии с Методикой госсортоиспытания (1989) и Методикой исследований эффективности препаратов ризосферных диазотрофов ( и др., 1998). Повторность опыта трехкратная, размещение вариантов рендомизированное. Общая площадь делянки – 66 м2, учетная – 50 м2. Новые препараты нарабатывались по (1991). Вегетирующие растения озимой пшеницы в фазе кущения-начала выхода в рубку опрыскивали водной суспензией препаратов из расчета 2 л/га и нормой расхода рабочей жидкости 400 л/га. Аналогично вносили азот в виде раствора карбамида из расчета 45 кг/га д. в.

Распространенность, развитие болезней озимой пшеницы и биологическую эффективность биопрепаратов изучали по общепринятым методикам в фазу молочно-восковой спелости пшеницы на флаговых листьях (, 1985; , 1994).

Статистическую обработку данных проводили в программе MS Excel по (1985).

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Выделение и скрининг эффективных штаммов PGPR

Из ризопланы диких злаков, собранных в разных природных зонах РСО-Алания на высотах от 110 до 3500 м н. у.м., было выделено 86 сообществ диазотрофных ассоциативных ризосферных бактерий (АРБ). В процессе «рассева» из них было изолировано 316 культур (изолятов) бактерий.

На первом этапе работы из общего числа отбирали небольшое количество перспективных изолятов АРБ, наиболее полно отвечающих предъявляемым требованиям. С этой целью был проведен скрининг бактерий на основании их способности стимулировать рост одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris 157 и подавлять фитопатогенный гриб Fusarium graminearum – возбудитель фузариоза колоса.

По результатам скрининга из 316 изолятов АРБ для дальнейших исследований было отобрано 30 изолятов, обладающих высокой ростстимулирующей и фунгистатической активностью, а также комплексом этих свойств.

3.1.1. Ростстимулирующая активность изолятов ризобактерий

Согласно результатам данного эксперимента протестированные ризобактерии по способности стимулировать рост зеленой водоросли Chlorella vulgaris 157 (табл. 1) можно условно разделить на 2 группы:

1) Штаммы-стимуляторы. Большинство штаммов, а именно – 20, характеризовалось большими зонами стимуляции хлореллы от 8 до 16 мм.

Нередко вокруг колоний тестируемых бактерий проявлялись сразу 2-3 зоны стимуляции, что подтверждает предположение о том, что бактерии могут синтезировать сразу несколько видов ростовых веществ. Некоторые штаммы, такие как 11-15, 11-16, 11-91, 26-44, 31-31, 31-32 и 33-3 по способности стимулировать Chlorella vulgaris 157 (зоны от 12 мм) не уступали, а в некоторых случаях даже превосходили эталонные штаммы ВНИИСХМ Azospirillum lipoferum 137 и Flavobacterium sp. L-30. Несколько меньшее влияние на рост хлореллы (зоны 8-11 мм) оказывали штаммы 11-14, 11-41, 11-42, 11-91, 11-92, 25-5, 32-31, 36-6, 38-21, 38-22, 39-11 и 67-92 Штаммы 26-41, 26-42, 26-43, 31-33 и 32-32 оказывали на рост хлореллы слабое воздействие, зоны усиленного роста водоросли были в пределах 4-7 мм.

2) Штаммы-ингибиторы 11-12, 17-1 и 18-5 характеризовались широкими зонами ингибирования, вызванными продукцией антифунгальных метаболитов, высокие концентрации которых ингибировали хлореллу; штаммы 11-11, 26-43б, 39-13, 67-91 образовывали меньшие зоны подавления, переходящие в зоны стимуляции, вызванные синтезом высоких концентраций ростстимулирующих веществ.

Таблица 1. Ростстимулирующая и фунгистатическая активность

отобранных штаммов PGPR

n=4

Штамм	Зона стимуляции, Chlorella vulgaris, мм	Зона ингибирования Fusarium graminearum, мм	Штамм	Зона стимуляции, Chlorella vulgaris, мм	Зона ингибирования Fusarium graminearum, мм
11-11	–2+3±1,14	4±0	26-44	+12±0	Т
11-12	–19±0	6±0	31-31	+16±1,14	0
11-14	+8±0	0	31-32	+13±0	0
11-15	+14±0	0	31-33	+6±0	0
11-16	+14±0	0	32-31	+8±0	Т
11-41	+11±0	0	32-32	+7±0	0
11-42	+9±0	0	33-3	+19±2,56	0
11-91	+12±0	0	36-6	+10±0	Т
11-92	+11±0	Т	38-21	+8±1,14	0
17-1	–16±1,14	10±1,14	38-22	+10±0	0
18-5	–24±1,14	12±0	39-11	+9±0	0
25-5	+10±0	2±0	39-13	–3+6±0	3±0
26-41	+5±0	0	67-91	–3+12±0	1±0
26-42	+4±0	0	67-92	+10±0	Т
26-43	+7±0	0	Azospirillum lipoferum 137	+12±0	8±0
26-43б	–4+4±0	0	Flavobacterium sp. L-30	+14±1,14	6±0

Примечание: – - ингибирование роста хлореллы; + - стимуляция роста хлореллы;

Т - толерантность к фузариуму; 0 - нулевая фунгистатическая активность к фузариуму

3.1.2. Антифунгальная активность штаммов ризобактерий.

Из 30 протестированных бактерий только 7 штаммов проявили антагонизм в отношении Fusarium graminearum. Максимальные зоны ингибирования роста гриба – 10-12 мм отмечены у штаммов 17-1 и 18-5, что свидетельствует о высоком уровне антифунгальной активности. Штаммы 11-11, 11-12, 25-5, 39-13 и 67-91 проявили слабое фунгистатическое действие. Их зоны подавления были в пределах 1-6 мм. Еще 5 штаммов (11-92, 26-44, 32-31, 36-6, 67-92) не оказали какого-либо влияния на рост фузариума, однако проявили толерантность по отношению к грибу – лунки не заросли мицелием.

На втором этапе исследований для отбора наиболее эффективных штаммов мы тестировали их по фунгистатической активности к спектру фитопатогенных грибов, фосфатмобилизующей, азотфисирующей, АЦК-дезаминазной активности, способности положительно влиять на рост высших растений, и другим важным показателям.

3.1.3. Фунгистатическая активность к спектру фитопатогенных грибов

У пяти наиболее активных штаммов (11-12, 17-1, 18-5, 25-5 и 39-13) изучали фунгистатическую активность к фитопатогенным грибам (табл. 2).

Таблица 2. Фунгистатическая активность штаммов PGPR к спектру

фитопатогенных грибов

n=4

Штамм	Зоны подавления роста патогена, мм
Fusarium graminearum	Fusarium oxysporum	Fusarium solani	Sclerotinia libozi	Rhizoctonia solani	Alternaria consartiale	Penicillium sp.	Macrosporium sp.
11-12	6±1,14	4±0	2±0	5±0	3±0	2±0	0	с
17-1	10±0	5±0	5±0	9±1,14	5±0	с	т	0
18-5	12±0	4±0	3±0	10±0	7±0	11±1,14	0	с
25-5	2±0	1±0	2±0	3±0	2±0	1±0	2±0	2±0
39-13	3±0	1±0	5±0	2±0	т	т	0	0
A. lipoferum 137	8±0	4±0	2±0	2±0	4±0	2±0	0	0
Flavobacterium sp. L-30	6±0	4±0	4±0	0	6±0	2±0	0	0

Примечание: т - толерантность к фитопатогену; с - стимуляция роста фитопатогена;