Комбинированные криоконсерванты в сохранении функций лейкоцитов (стр. 1 )

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ

КОМИ НАУЧНОГО ЦЕНТРА УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи 

ПОЛЕЖАЕВА ТАТЬЯНА ВИТАЛЬЕВНА

КОМБИНИРОВАННЫЕ КРИОКОНСЕРВАНТЫ В СОХРАНЕНИИ ФУНКЦИЙ ЛЕЙКОЦИТОВ

14.01.21 – гематология и переливание крови

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Научный консультант 

доктор медицинских наук профессор

Сыктывкар - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………………….….	1
ГЛАВА I СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ВЛИЯНИИ ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ ТЕМПЕРАТУР НА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ КЛЕТОК (обзор литературы) ..……………………………………………………...	13
1.1 Факторы криоповреждения и криозащиты клеток. Гипотезы, теории, концепции ………………………………….…	13
1.2 Криопротекторы и криоконсерванты ……………………..	28
1.3 Методы оценки функционального состояния клеток, подвергнутых криовоздействию ……………………………….…	40
1.4 Методы криоконсервирования лейкоцитов ……………….	48
ГЛАВА II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ………...........	55
2.1 Характеристика объекта исследования ……………………	55
2.2 Разработка новых комбинированных криозащитных растворов, обеспечивающих сохранность лейкоцитов при различных отрицательных температурах ………………………..	55
2.3 Методы исследования физико-химических свойств криозащитных растворов ……………………………………….…	61
2.4 Биологические методы исследования криозащитных растворов ……………………………………………………….…..	62
2.5 Разработка программ замораживания и отогрева лейкоцитов ………………………………………………………....	64
2.6 Методы оценки структурно-функционального состояния лейкоцитов, подвергнутых воздействию отрицательных температур ……………………………………………………….…	70
2.7 Методы статистического анализа ……………………….….	75
ГЛАВА III РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ …………………………...	76
3.1 Структурно-функциональные показатели лейкоцитов, перенесших воздействие температуры переохлаждения (–10ºС) ……..…………………………………………………….…	76
3.2 Структурно-функциональные показатели лейкоцитов, перенесших воздействие субумеренно-низкой температуры (–20ºС) …………………………………………………….………..	90
3.3 Структурно-функциональные показатели лейкоцитов, перенесших воздействие умеренно-низкой температуры (–40ºС) …...........................................................................................	100
3.4 Структурно-функциональные показатели лейкоцитов, перенесших воздействие низкой температуры (–80ºС) ………....	111
3.5 Физико-химические и биологические свойства эффективных криозащитных растворов........................................	123
ГЛАВА IV ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ …………………................	136
ВЫВОДЫ …………………………………………………………………….	162
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ …………………………………….	164
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ …………………………………………………...	166

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1,2-ПД – пропандиол или α-пропиленгликоль

АОА – антиоксидантная активность

АФК – активные формы кислорода

А-378 или ГМБТОЭМ – гексаметиленбистетрагидроксиэтилмочевина

ГМФШ – гексозомонофосфатный шунт

ГЭК – гидроксиэтилкрахмал

ДМАЦ – диметилацетамид

ДМСО – диметилсульфоксид

ЛД 50 – средняя летальная доза

ЛК – лейкоконцентрат

ЛКБ – лизосомально-катионные белки

НАДФ – никотинамиддинуклеотидфосфат

НСТ – нитросиний тетразолий

ОМЭПС – сукцинат гидроксиметилэтилпиридина

ПВП – поливинилпирролидон

ПОЛ – перекисное окисление липидов

ПЭО-400 – полиэтиленоксид с молекулярной массой 400

СЦК – средний цитохимический коэффициент

ФАН – фагоцитарная активность нейтрофилов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Для создания общей теории криоповреждения и криозащиты клеток, а также эффективных научно обоснованных методов их криоконсервирования важным является всестороннее изучение структурно-функциональных изменений биологических мембран (плазматических, ядерных, лизосомальных и др.) и метаболических процессов, протекающих с их участием. Изменения окружающей среды (понижение температуры, вымерзание воды, рН, электролитный баланс, вязкость, появление чужеродных молекул и др.) первыми воспринимают плазматические мембраны. Основной причиной их первичных повреждений являются нарушения распределения липидов, обеспечивающих высокую пластичность и растяжение мембраны. С трансформацией липидных компонентов взаимосвязаны фазово-структурные переходы фракций клеточной воды (свободной, связанной, фиксированной), каждая из которых имеет свою зону кристаллизации с определенной степенью замедления метаболизма (Сведенцов, 2004). С учетом того, что существенное снижение метаболических процессов в клетке наступает при низкой температуре (–70° ÷ –98°С) общепринятым является консервирование клеток при температурах ниже указанных с применением жидкого азота.

Для эритроцитов и тромбоцитов крови человека используют способы консервирования (Чечеткин и др., 2005) при температурах от –20°С до –80°С в электрорефрижераторах под защитой криоконсервантов. В зависимости от используемой температуры срок хранения клеток составляет от 1 года до 5 лет. Применение электрических холодильников позволяет отказаться от громоздкого, дорогостоящего оборудования и не зависит от периодического восполнения запасов азота, кратковременные колебания в них температур не являются фатально губительными для клеточного материала. Все это имеет важное значение в практической деятельности криобанков. Возможность сохранности ядросодержащих клеток при температурах выше –196°С остается малоизученной, что связано с быстрым истощением энергетических запасов и накоплением продуктов метаболизма.

Для повышения криоустойчивости биообъекта используют криопротекторы и стабилизирующие добавки. Действие первых основано на способности создавать прочные связи с молекулами воды (вне и внутри клетки, более прочные, чем связи воды между собой) и на способности снижать концентрацию солей, что делает минимальным риск повреждения белковых структур клеток, а также образовывать связи со структурными компонентами мембраны, предохраняя их от разрушения кристаллами льда. Всего в мире обнаружено и создано более 120 криофилактических средств с экзоцеллюлярным, эндоцеллюлярным и смешанным криозащитным действием. Однако выраженными криопротекторными свойствами обладают: глицерин, ДМСО (диметилсульфоксид), ДМАЦ (диметилацетамид), 1,2-ПД (пропандиол), ПЭО-400 (полиэтиленоксид), которые имеют определенную токсичность и требуют отмывания после размораживания биообъекта, что дополнительно травмирует клетки. С 2003 г Минздравом РФ разрешено использование высокоочищенного ДМСО для криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток периферической крови и костного мозга. Производство криоконсервантов в России осуществляется главным образом в лабораторных условиях с использованием зарубежных протекторов.

В последние годы положительно зарекомендовало себя применение комбинированных криозащитных растворов, состав которых по причине видоспецифичности биологического объекта весьма вариабелен: классические экзо - и эндоцеллюлярные протекторы (Корниенко, Бондаренко, 2008; Сведенцов, 2010); обладающие протекторным действием антифризные протеины, гликопротеины (Андреев и др., 2008) и клатратные соединения инертных газов (Тельпухов, Щербаков, 2006; Sheleg et al., 2008); антиоксиданты и стабилизаторы биологических мембран, усиливающие устойчивость клеток к эндо - и экзогенным факторам физико-химического воздействия (Dalvit et al., 1988; Carrol J. et al., 1993), активаторы энергетического метаболизма клеток - гетерозиды (Кабачный, Горбунова, 2004); стабилизаторы температур замораживания и отогрева - наночастицы ферромагнетика (Сукач и др., 2008).

Однако, несмотря на достигнутые успехи, продолжается поиск универсального для различных клеток и тканей криопротектора. Актуальным остается разработка эффективных технологий длительного хранения биообъектов в нетоксичных криоконсервантах при широком диапазоне отрицательных температур.

Цель исследования – определить сохранность функций лейкоцитов при температурах от –10°С до –80°С с применением комбинированных криоконсервантов.

Задачи исследования:

1. Разработать комбинации криозащитных растворов, содержащие криопротекторы с различной проникающей способностью и реставрирующие компоненты, не требующие отмывания после отогрева биообъекта.

2. Сравнить влияние комбинированных криозащитных растворов на степень устойчивости лейкоцитов к воздействию отрицательных температур: переохлаждения (–10°С), субумеренно-низкой (–20°С), умеренно-низкой (–40°С), низкой (–80°С).

3. Установить возможные сроки структурно-функциональной сохранности лейкоцитов в условиях указанных отрицательных температур под защитой разработанных криозащитных растворов.

4. Определить влияние эффективных криозащитных растворов на характер перекисных процессов в мембранах лейкоцитов на разных этапах криоконсервирования и при варьировании сроков хранения.

5. Изучить физико-химические и биологические особенности (токсичность, пирогенность) эффективных криозащитных растворов и определить переносимость лабораторными животными внутривенных аутогемотрансфузий криоконсервированных с данными растворами лейкоцитов.

6. Разработать способы электрорефрижераторного криоконсерви-рования лейкоцитов крови в нетоксичных ограждающих растворах при температурах от –10°С до –80°С.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Комбинирование в замораживаемой биосреде непроникающих и проникающих криопротекторов, антиоксидантных и противогипоксантных компонентов обеспечивает высокую криоустойчивость лейкоцитов периферической крови при замораживании – отогреве и позволяет снизить токсичность ограждающего раствора.

2. Предложенные комбинированные криоконсерванты не вызывают активацию перекисного окисления липидов в мембранах лейкоцитов и обеспечивают сохранность морфофункциональных параметров у более 75% клеток по разным тестам при –10°С в течение 9 суток (патент РФ № 2 2005), при –20°С - 21 суток (патент РФ № 2 2004), при –30°С - 30 суток (патент РФ №2 2002) и при –80°С в течение 180 суток (срок наблюдения; патент РФ № 2 2007).

3. Комбинированные криозащитные растворы нетоксичны, апирогенны и хорошо переносятся лабораторными животными в смеси с размороженными аутологичными лейкоцитными концентратами.

4. Способы электрорефрижераторного криоконсервирования лейкоцитов крови при температурах от –10°С до –80°С являются эффективными, доступными для широкого использования и рекомендуются в качестве альтернативы замораживанию биообъектов в жидком азоте.

Научная новизна. В лабораторно-экспериментальном исследовании на примере лейкоцитов крови человека показана эффективность комбинирования в замораживаемой клеточной среде непроникающих и проникающих криопротекторов, реставрирующих компонентов, что обеспечивает сохранность биологического объекта при температурах от –10°С до –80°С и позволяет снизить токсичность ограждающего раствора, что доказано в опытах на экспериментальных животных.

Предложено охлаждение лейкоцитов до –10°С по нелинейной программе в незамерзающем криоконсерванте, содержащем проникающий протектор глицерин (в исходной концентрации 7%), непроникающий протектор желатин со средним молекулярным весом 16 кДа (7,5%) и антигипоксант-антиоксидант ОМЭПС (0,3%), что обеспечивает криоустойчивость более 75% лейкоцитов по разным тестам в течение 9 суток хранения.

Криопротектор смешанного действия ГМБТОЭМ обеспечивает указанную сохранность лейкоцитов в широком диапазоне температур: при –20°С в исходной концентрации 28% совместно с ОМЭПС (0,2%) в течение 21 суток; при –40°С в концентрации 30% совместно с антигипоксантом фумаратом натрия (2,8%) и лимонной кислотой (0,06%) в течение 30 суток; при –80°С в концентрации 22% совместно с проникающим протектором ДМСО (8%) и ОМЭПС (0,4 %) в течение 180 суток (срок наблюдения). На основании полученных данных, а также имеющихся сведений об эффективности применения указанного криопротектора при ультранизком замораживании тромбоцитов и клеток костного мозга сформулирована концепция об универсальном криозащитном действии данного вещества.

Найден новый вид непроникающих криопротекторов – растительные полисахариды, которые наряду с иммуномодулирующими свойствами способны оказывать криозащитный эффект за счет своих функциональных групп и не обладают токсичностью. Впервые показана перспективность использования лемнана пектинового полисахарида ряски малойАктуальным остается в составе комбинированной криозащитной среды для –10°С. Установлено, что криоконсервант, содержащий глицерин (в исходной концентрации 7%), лемнан со средним молекулярным весом 400 кДа (0,3%) и ОМЭПС (0,3%) обеспечивает сохранность исходных морфофункциональных параметров у лейкоцитов в течение 1 суток.

Теоретическая и практическая значимость. Получены новые сведения о возможности хранения ядросодержащих клеток не только в условиях ультранизкой (–196°С) температуры, но и при температурах от –10°С до –80°С, что является ценным для трансфузиологии, ветеринарной медицины, микробиологии, ихтиологии.

Результаты проведенных исследований вносят вклад в создание общей теории криоповреждения и криозащиты клеток, т. к. указывают на то, что в используемых нетоксичных комбинациях консервантов каждый протектор проявляет защитное свойство при определенных температурных условиях, что в итоге позволяет устранить несколько причин криоповреждения клеток с сохранением аддитивной криопротекторной эффективности выбранной комбинации ингредиентов.

Показана эффективность применения электрорефрижераторной технологии консервирования биообъектов при температурах от –10°С до –80°С в нетоксичных комбинированных консервантах, которая отличается от традиционной с использованием жидкого азота простотой выполнения и не требует дорогостоящего оборудования. С практической точки зрения важным является использование электрических морозильников и щадящих нелинейных программ замораживания, предупреждающих выброс кристаллизационного тепла и последующую рекристаллизацию, вызывающую гибель клеток. Особую значимость представляют предложенные криозащитные растворы (патенты РФ: № 2 2002; № 2 2004; № 2 2005; № 2 № 2 2007; № 2 2012), которые не уступают по своей эффективности существующим консервантам, но при этом являются нетоксичными и не требуют отмывания клеток перед применением, что увеличивает число жизнеспособных лейкоцитов и снижает экономические затраты. Предложенные технологии криоконсервирования ядросодержащих клеток периферической крови являются доступными широкому кругу учреждений и могут быть использованы при создании запаса клеток для его одномоментного использования при ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций вследствие техногенных причин, природных явлений, террористических актов и вооруженных конфликтов, частота появления которых увеличивается в последние годы, а также для сохранения биоматериала во время космических перелетов, в длительных научных экспедициях.

Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе в ФГБОУ ВПО «Вятский государственный гуманитарный университет» и ГБОУ ВПО «Кировская государственная медицинская академия» Минздрава России.

Апробация работы. Результаты работы доложены и обсуждены на Международных конференциях: «Сохранение генетических ресурсов» (С.-Петербург, 2004), «Криоконсервация как способ сохранения биологического разнообразия» (Пущино, 2008), «Фундаментальные и прикладные аспекты физиологии» (Гродно, 2009); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Киров, 2010); на XVIII и XIХ Съездах Всероссийского физиологического общества им (Казань, 2001; Екатеринбург, 2004); на Всероссийских научно-практических конференциях «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (С. Петербург, 2002, 2007); на Всероссийских совещаниях «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины (Киров, 2008, 2012); на научной сессии Кировского филиала РАЕ и Кировского областного отделения РАЕН (Киров, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 59 научных работ, в том числе 1 монография, 6 патентов Российской Федерации, 4 статьи в зарубежных, 10 статей в Российских рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов), выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 200 машинописных страницах, содержит 34 таблицы и 31 рисунок. Список литературы включает 342 источник, в том числе 124 статьи зарубежных авторов.

Работа выполнена в лаборатории криофизиологии крови Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН в рамках плановых тем НИР «Функциональная активность ядросодержащих клеток крови, перенесших холодовой анабиоз разной глубины» (ГР № 01.и «Закономерности восстановления функциональной активности ядросодержащих клеток крови, подвергнутых воздействию отрицательных температур» (ГР № 000Частично работа получила финансовую поддержку Российского фонда фундаментальных исследований (№).

Глава I СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ВЛИЯНИИ ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ ТЕМПЕРАТУР НА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ КЛЕТОК

(обзор литературы)

1.1 Факторы криоповреждения и криозащиты клеток. Гипотезы, теории, концепции

При охлаждении клеток от 0°С до –196°С многообразие проявлений криоповреждений зависит от неблагоприятного воздействия комплекса факторов, среди которых существенное значение имеют образование кристаллов экзо - и эндоцеллюлярного льда, избыточная дегидратация и фазовые превращения биополимеров и надмолекулярных структур, гиперконцентрация солей и ионной силы раствора, изменение величины рН и зарядовых характеристик мембран.

Большинством авторов (, , и др., 1983; и др., 1987, 1988, 1994; Smith A. U., 1961, 1963) принято, что основные повреждения клетки получают при фазовом переходе воды в лед, что связано с образованием кристаллов льда вне и внутри замораживаемых клеток. При непосредственном наблюдении процесса замораживания клеток под микроскопом установлено ( и др., 1975, 1976, 1977; Diller K. R. et al., 1975; Mazur P., 1984), что образование внеклеточного льда опережает образование льда внутри клеток.

Молекулы воды вследствие электростатического притяжения их полярных участков стремятся к образованию льдоподобных агрегатов (, , 2010). По мере снижения температуры и замедления теплового движения молекул воды тенденция к агрегации усиливается, а вероятность возникновения критически большого кластера молекул быстро увеличивается. В результате гомогенной нуклеации (спонтанной агрегации молекул воды) формируется зародыш кристалла льда большого размера. Критический размер кластера при –5°С - около 45000 молекул воды, а при –40° - лишь 70 (Vali G., 1995). При наличии в воде нуклеаторов льда или льдонуклеирующих агентов (чужеродных частиц и примесей) происходит гетерогенная нуклеация (как правило, в диапазоне от –2°С до –15°С), которая зависит от химической природы и концентрации вещества в замерзающей системе. Фазовый переход воды (внеклеточной и внутриклеточной) из жидкого в твердое состояние при замораживании биообъектов происходит в широкой температурной зоне – от температуры начала кристаллизации до полного отвердевания образца в зоне эвтектических температур (Merymen H.T., 1974).