Фармакогностическое исследование некоторых видов рода stellaria и возможность их использования в медицинской практике (стр. 3 )

Определение молекулярно-массовых характеристик, доминирующих по выходу полисахаридов (табл. 4), проводили методом ВЭЖХ на колонке OHpak SB-804 HQ (Shodex, США). Наличие в образцах полисахаридов 2-4 пиков с широким диапазоном молекулярных масс (от 5,15 до 2040,17 кДа) свидетельствует об их гетерогенности по молекулярной массе (табл. 4).

Таблица 4 – ВЭЖХ анализ фракций полисахаридов звездчатки средней, полученных при хроматографировании на DEAE-целлюлозе

Образец	Площадь, %	Mn, кДа	Mw, кДа	Mw/Mn
SM 1-1 (0,1 М/л NaCl)	1,23	951,05	1371,43	1,44
14,24	81,47	94,83	1,15
84,53	6,58	12,70	1,93
SM 1-2 (0,2 М/л NaCl)	100	15,40	41,78	2,71
SM 2-1 (0,1 М/л NaCl)	4,15	1893,96	2040,17	1,08
5,30	560,34	668,72	1,19
59,98	24,11	45,76	1,90
30,58	3,92	5,15	1,32
SM 2-2 (0,2 М/л NaCl)	100	20,59	124,85	6,06
SM 3-1 (0,1 М/л NaCl)	2,47	636,66	1069,95	1,68
98,53	7,47	13,13	2,56
SM 3-2 (0,2 М/л NaCl)	100	20,87	55,72	2,67
SM 3-3 (0,3 М/л NaCl)	100	55,08	106,90	1,94

Примечание. Mn – среднечисловая молекулярная масса, Mw – средневесовая молекулярная масса, Mw/Mn - полидисперстность.

Для очистки исследуемых образцов SM 1-1…SM 3-3 (табл. 5) от белковых компонентов использовали гель-хроматографию на сефакриле S-300, однако не удалось освободиться от белка, содержание которого уменьшилось незначительно. Полученные данные могут свидетельствовать о наличии ковалентной или ионной связи между белковыми и углеводными компонентами в выделенных фракциях.

Исследование сапонинов звездчатки средней

Для проведения химических исследований из надземной части растения получали экстракт на 70% водном этаноле (выход 27,2%), который затем фракционировали рядом растворителей с возрастающей полярностью (хлороформом, этилацетатом, бутанолом-1). Полученные фракции исследовали хроматографией в тонком слое с достоверными образцами в системе растворителей хлороформ-метанол-вода (61:32:7) и детекцией пятен 25% спиртовым раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты. В результате в бутанольной фракции обнаружили 3 тритерпеновых гликозида. Разделение суммы сапонинов проводили методом адсорбционной колоночной хроматографии на силикагеле (L 40/100), а элюирование осуществляли системой растворителей хлороформ-метанол-вода (61:32:7). В результате из бутанольной фракции были выделены три вещества (стеллярозид А, В и С), которые подвергались полному кислотному гидролизу. Методом хроматографии в тонком слое с достоверными образцами в системе растворителей хлороформ-этанол (8:2) было установлено, что агликоном является олеаноловая кислота (Rf=0,48), а моносахаридный состав стеллярозида А представлен глюкозой, галактозой, стеллярозида В – галактозой, арабинозой, стеллярозида С – глюкозой, арабинозой и глюкуроновой кислотой (GlcA).

Изучение гепатопротективной и антиоксидантной активности звездчатки средней

Рассматривая полученные нами результаты фитохимического анализа основных групп БАВ з. средней, можно заключить, что доминирующими природными соединениями данного растения являются вещества гидрофильного характера, в частности полисахариды. В связи с этим, наибольший интерес для фармакологических исследований представляет водный экстракт з. средней, использующийся в народной медицине при многих заболеваниях, в том числе и при патологии печени, а также фракция ВРПС, выделенная из водного извлечения путем осаждения 96% этанолом, обладающая широким спектром биологической активности.

Гепатопротективную активность оценивали по морфологическим и биохимическим показателям, антиоксидантную – по влиянию на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в печени и сыворотке.

После курса применения экстракта и фракции ВРПС з. средней у крыс с токсическим гепатитом наблюдалось усиление репаративных процессов в печени. Наблюдавшаяся положительная динамика обусловлена нормализацией процессов ПОЛ за счет активации антирадикальной системы (повышение активности каталазы и антирадикальной активности до нормы). Эти процессы способствовали восстановлению мембран гепатоцитов, нормализации их функционального состояния и предотвращали повышенный выход ферментов в кровь, о чем свидетельствовали параметры содержания аминотрансфераз – АлАт и АсАт, которые не отличались от контрольной группы. В этих же условиях у крыс нормализовалась желчевыделительная функция (уровень щелочной фосфатазы в норме). При этом экстракт з. средней по сравнению с действием фракции ВРПС несколько в большей степени усиливал активность щелочной фосфатазы и активировал систему антиоксидантной защиты (активность каталазы и антирадикальную активность).

Морфологические показатели свидетельствуют, что применение экстракта и фракции ВРПС з. средней препятствовали развитию структурно-функциональных и метаболических нарушений печени, что проявляется в снижении содержания некротизированных клеток, гепатоцитов с дистрофией, плотности клеточного инфильтрата. Однако количество двуядерных гепатоцитов возросло по сравнению животными с гепатитом, что указывает на благоприятное воздействие экстракта и фракции ВРПС, стимулирующих белок-синтетические и пролиферативные процессы печеночной клетки.

Таким образом, установлено, что экстракт и фракция ВРПС з. средней, обладают гепатозащитным и антиоксидантным действием аналогично карсилу – известному антигепатотоксичному препарату, полученному из лекарственного растительного сырья.

Испытания на острую токсичность показали, что сухой экстракт в дозе 10 г/кг массы крысы не вызывает гибель животных, следовательно не обладает острой токсичностью, что соответствует IV классу опасности «вещества малоопасные» (ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества»)

Разработка параметров стандартизации надземной части

звездчатки средней

В результате анатомического исследования надземной части з. средней были определены следующие диагностические признаки, позволяющие отличить ее от близкородственных видов (з. Бунге, з. злаковой и з. ланцетолистной): наличие волосков различного типа – головчатых волосков с многоклеточной ножкой и одноклеточной головкой у основания листа и по центральной жилке чашелистика цветка, многоклеточных тупоконусовидных волосков у основания прицветного листа; непучковый тип строения стебля.

Числовые показатели для цельного и измельченного сырья определяли в соответствии с методиками ГФ XI. Влажность сырья составила 7,4±1,2%; зола общая – 18,2±0,44%; зола, нерастворимая в 10% растворе кислоты хлористоводородной 1,0±0,3%; органическая примесь 1,0±0,1%; минеральная примесь 0,4±0,1%. Основная часть измельченного сырья проходит сквозь сита с диаметрами отверстий 1-5мм (87,7%). Сквозь сито с диаметром отверстий 7 мм не проходит 3,3±0,9%. Через сито 0,25 мм отсеивается 0,8±0,2%.

Подлинность и содержание действующих веществ определяли по полисахаридам, которые, по полученным нами данным, имеют существенное значение в проявлении гепатопротективной и антиоксидантной активности экстракта з. средней. Предварительно были отработаны условия проведения экстракции (соотношение сырье-экстрагент, температура, кратность и время экстракции, степень измельчения сырья).

Установлено, что оптимальными условиями экстракции являются: трехкратная экстракция водой очищенной в соотношении 1:25 в течение 1 ч при температуре 80 °С сырья, проходящего сквозь сито с диаметром пор 2-4 мм (рис. 2).

Для установления подлинности надземной части з. средней предложены следующие реакции: на полисахариды – реакция осаждения этанолом, на галактуроновую кислоту (входящей в состав полисахаридов) – реакция с 3,5-диметилфенолом.

Количественное определение полисахаридов проводили методом спектрофотометрии на основе реакции сахаров, полученных при гидролизе полисахаридов, с антроном в присутствии серной кислоты. Расчет процентного содержания полисахаридов проводили с использованием калибровочного графика, построенного по глюкозе.

Валидационную оценку методики количественного определения полисахаридов проводили по следующим показателям: повторяемость, правильность и воспроизводимость. Содержание полисахаридов в надземной части з. средней должно быть не менее 2%. При этом значение относительной погрешности составляет менее 3 % при доверительной вероятности 0,95.

Используя разработанную методику, установлено, что максимальное содержание полисахаридов наблюдается в период массового цветения и составляет 4,7±0,1%.

На основании проведенных исследований разработан проект ФС «Звездчатки средней трава».

мин

1:10 1:15 1:20 1:25 1:30

60ºС

1 мм

Рисунок 2 – Влияние условий экстракции на выход полисахаридов (%) из надземной части звездчатки средней: соотношение сырья и экстрагента (1), время экстракции (2), кратность экстракции (3), температура (4) и степень измельчения сырья (5)

Получение сухого экстракта из надземной части

звездчатки средней и его стандартизация

Установленные при разработке методики количественного определения полисахаридов в надземной части з. средней оптимальные параметры экстракционного процесса, при которых достигается наиболее полный выход действующих веществ (полисахаридов), позволили предложить способ получения средства, обладающего гепатопротективной и антиоксидантной активностью, заключающийся в экстракции надземной части з. средней, измельченной до размеров частиц 2-4 мм, водой очищенной при температуре 80 °С в течение 1 ч при соотношении сырье-экстрагент 1:25 и кратности экстракции 3 с последующим удалением экстрагента при пониженном давлении и высушиванием досуха полученного экстракта.

Сухой экстракт з. средней представляет собой сыпучий порошок темно-коричневого цвета со своеобразным запахом. Его стандартизация проведена по методикам ГФ XI издания. Определены потеря в массе при высушивании (3,88±0,12%) и проведены испытания на тяжелые металлы (не более 0,01%). В основу стандартизации сухого экстракта положены методики определения подлинности и количественного содержания полисахаридов, описанные ранее для надземной части. Содержание полисахаридов в сухом экстракте з. средней составило 8,8±0,2% при относительной ошибке 2,6%.

ВЫВОДЫ

1. С помощью химических, хроматографических и спектральных методов установлено содержание в надземной части S. bungeana Fenzl, S. graminea L., S. holostea L., S. media L. следующих групп БАВ: полисахаридов, тритерпеновых гликозидов, олеоноловой кислоты, кумаринов, дубильных веществ, каротиноидов, аскорбиновой кислоты и показано, что в данных растениях, произрастающих в Западносибирском регионе, в отличии от европейского происхождения, флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты содержаться лишь в следовых количествах.

2. Впервые осуществлено углубленное исследование полисахаридов S. media. Набором современных методов (ИОХ, гель-хроматография, ГЖХ, ВЭЖХ) выделены и охарактеризованы 3 фракций, при этом в состав углеводных цепей двух фракций водорастворимых полисахаридов (SM 1 и SM 2) входят остатки метилэтерифицированной галактуроновой кислоты, глюкозы, галактозы, арабинозы, рамнозы, ксилозы и маннозы, а третья фракция представлена пектиновым полисахаридом с преимущественным содержанием галактуронана.

3. В результате анатомического исследования надземных частей 4-х видов рода Stellaria установлены диагностические признаки листа, стебля и цветка, заключающиеся в степени извилистости клеток эпидермы, типе устьичного аппарата, строении и количестве волосков, особенностях кутикулы и наличии полости сердцевины стебля, позволяющие различать виды друг от друга.

4. Установлено, что сухой экстракт и фракция водорастворимых полисахаридов S. media при ежедневном в течение 6 дней пероральном применении в дозе 100 мг/кг у крыс с экспериментальным токсическим гепатитом активируют регенераторно-репаративные процессы в печени и систему антиоксидантной защиты, что свидетельствует о наличии гепатопротекторной и антиоксидантной активности, по выраженности сопоставимой с активностью стандартного гепатопротекторного средства карсила. Фракция водорастворимых полисахаридов в указанных условиях восстанавливает показатели иммунологической реактивности, проявляя выраженный иммуномодулирующий эффект.

5. Разработанные методики стандартизации сырья и на их основе проект ФС «Звездчатки средней трава» дают возможность ее внедрения в качестве сырьевого источника получения гепатопротективного средства.

6. Впервые предложен способ получения сухого экстракта из надземной части S. media, обладающего гепатопротективной и антиоксидантной активностью, при котором достигается максимальное извлечение полисахаридов (степень измельчения сырья 2-4 мм, соотношении сырье-экстрагент (вода очищенная) 1:25, время экстракции 1 ч, температура 80 °С и кратность экстракции 3), и определены основные показатели его качества.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Горина, изучение растений рода Звездчатка / , , // Фармация. – 2010. – №6.– С. 22-24.

2. Горина, исследование некоторых видов рода Stellaria / , // Журнал Сибирского федерального университета. Химия. – 2010. – №3. – С. 200-203.

3. Горина, свойства водного экстракта из надземной части Stellaia media (Caryophyllaceae) / , , // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. – 2010. – №10. – С. 35-39.

4. Горина анатомическое исследование некоторых видов рода Stellaria / , , // Вестник ТГУ. Биология. – 2011. – Т. 15, №3. – С. 71-74.

5. Краснов, состав некоторых перспективных видов флоры Сибири и возможность их практического использования / , , // Тез. докл. IV Всеросс. конф. «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья». – Барнаул, 2009. – Т. 2. – С. 181-182.

6. Горина, и фитохимическое исследование надземной части Stellaria media L. / , , // Тез. докл. международ. науч.-практ. конф. «Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства». – Шымкент, Казахстан, 2009. – С. 218-220.

7. Горина, характеристика химического состава и особенностей анатомического строения двух видов рода Stellaria / , , // Тез. докл. межрегион. науч.-практ. конф. «Фармацевтическая наука и практика: достижения и перспективы». – Кемерово, 2009. – С.41-42.

8. Горина, -фармакологическое исследование водного экстракта из надземной части Stellaria / , , // Тез. докл. VII Всеросс. конф. «Химия и медицина, Орхимед-2009». – Уфа, 2009. – С. 154-155.

9. Бабешина, состав растений рода Stellaria и Sphagnum / , , // Тез. докл. 65-ой регион. конф. «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». – Пятигорск, 2010. – С. 11-13.

10. Горина, химического состава видов Stellaria и возможность использования их в медицине / , , // Тез. докл. Всеросс. конф. «Химия и полная переработка биомассы леса». – Санкт-Петербург, 2010. – С. 260-261.

11. Горина, химического состава и анатомических признаков некоторых видов рода Stellaria / , , // Тез. докл. Всеросс. конф. «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии». – Томск, 2010. – C. 264-266.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЭС – атомно-эмиссионная спектроскопия;

БАВ – биологически активные вещества;

БХ – бумажная хроматография;

ВРПС – водорастворимые полисахариды;

ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография;

ГЖХ – газожидкостная хроматография;

ИОХ – ионообменная хроматография;

НАА – нейтронно-активационный анализ;

ПВ – пектиновые вещества;

ПОЛ – перекисное окисление липидов;

УФ – ультрафиолетовый;

ФС – фармакопейная статья.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю признательность и благодарность к. б.н., доц. кафедры фармакогнозии с курсами ботаники и экологии Г за помощь в выполнении анатомического исследования изучаемых растений; к. б.н., с. н.с. ЦНИЛ СибГМУ и к. м.н. за руководство фармакологическими и биохимическими исследованиями; д. х.н., академику, директору Института Физиологии Коми НЦ УрО РАН , к. х.н., доц. за руководство и помощь в выполнении исследований полисахаридов.

(Россия)

Фармакогностическое исследование некоторых видов рода Stellaria и возможность их использования в медицинской практике

Проведен сравнительный фитохимический анализ надземной части звездчатки Бунге, звездчатки злаковой, звездчатки ланцетолистной и звездчатки средней. Изучен макро - и микроэлементный состав 4-х видов рода Stellaria и содержание биоэлементов в надземной части звездчатки средней в зависимости от места произрастания. Из надземной части звездчатки средней выделена доминирующая группа биологически активных веществ – полисахариды и охарактеризован ее компонентный состав. Разработаны методики качественного обнаружения и количественного определения полисахаридов в надземной части звездчатки средней. Изучено содержание полисахаридов в надземной части звездчатки средней в зависимости от фазы развития и места произрастания растения. Проведено сравнительное анатомическое исследование надземной части 4-х видов звездчатки и выявлены их диагностические признаки. Экспериментально обоснована возможность использования звездчатки средней в качестве источника гепатопротективного средства, и целесообразность стандартизации растения по полисахаридам. На основании полученных экспериментальных данных предложен способ получения сухого экстракта с гепатопротективной и антиоксидантной активностью и определены основные показатели его качества.

Gorina Yana (Russia)

Pharmacognostical study of Stellaria genus some species and possibility of it’s using in medical practice

The comparative phytochemical analysis of the aerial parts of Stellaria bungeana, Stellaria graminea, Stellaria holostea and Stellaria media was carried out. It is studied macro - and microelement composition of four species of Stellaria genus. The content of bio-elements in Stellaria media aerial part depending on a growth place was studied. The polysaccharides as a dominant group of biologically active substances were isolated from Stellaria media aerial part and its composition was described. The techniques of qualitative and quantitative determination of Stellaria media polysaccharides were elaborated. The content of Stellaria media polysaccharides depending on a vegetation phase and a plant growth place was studied. The comparative anatomic research of four species of Stellaria genus was carried out and diagnostic characteristics were revealed. The possibility of Stellaria media using as a source of hepatoprotective remedy and expediency of plant standardization by polysaccharides was experimentally proved. On the basis of experimental data the way of obtaining of a dry extract with hepatoprotective and antioxidant activity was offered. The basic quality indicators were determined.

Подписано в печать «__»_______2012 г.

Усл. печ. листов 1,5 Печать на ризографе.

Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии СибГМУ

г. Томск, Московский тракт, 2,

Заказ №__ Тираж 110 экземпляров