Патогенетическое обоснование местного применения в биоактивных раневых покрытиях модифицированного серебром монтмориллонита и водорастворимой формы фуллерена с60 (фуллеренола) (стр. 2 )

Экспериментальные исследования, выполненные в работе

Цель исследования и характер оперативного вмешательства	Количество крыс (n=290)
Влияние водных растворов фуллеренола на супероксиданионпродуцирующую активность тканевых макрофагов	20
Определение биосовместимости разработанных матриц раневых покрытий	20
Морфофункциональные изменения в тканях внутренних органов при парентеральном (внутрибрюшинном) введении фуллеренола	30
Влияние парентерального (внутрибрюшинного) введения водного раствора фуллеренола на биохимические и клеточные показатели крови у крыс	60
Способность разработанных раневых покрытий подавлять рост микрофлоры в инфицированной ране	40
Сравнительное исследование эффективности разработанных раневых покрытий и коммерческих аналогов при лечении - инфицированных кожно-плоскостных ран - гранулирующих ран после глубоких ожогов	60 60

Для проверки биосовместимости, разработанные матрицы раневых покрытий были применены для местной аппликации в эксперименте на 20 животных, у которых воспроизводили по 2 условно асептических кожно-плоскостных раны. Моделирование ран выполняли путем иссечения участков кожи и поверхностной фасции размерами 2,0x2,0 см на спине крыс. После подготовки (осушения и контроля гемостаза) поверхность ран покрывали матрицами раневых покрытий размером 2,5x2,5 см, так, чтобы образец матрицы полностью перекрывал зону раневого дефекта и частично заходил на область здоровых тканей. Перевязки с повторной аппликацией матриц покрытий выполняли через день. Критериями эффективности служили скорость заживления и гистоморфологическая картина ран на 7-е сутки.

Сравнительное исследование эффективности разработанных раневых покрытий и коммерческих аналогов при лечении гранулирующих ран после глубоких ожогов выполнено на 120 крысах.

Глубокие ожоги у 60 животных моделировали с помощью специального устройства. В качестве обжигающей поверхности использовали медные пластины размерами 2×2 см с температурой нагрева 180ºС. Ожог наносили контактным способом в течение 15 секунд. Через сутки после моделирования ожога под эфирным наркозом выполняли некрэктомию ожогового струпа и аппликацию раневых покрытий.

Для воспроизведения модели инфицированных кожно-плоскостных ран 60 животным под эфирным наркозом производили разрез кожи на спине до фасции длиной 4 см, затем отслаивали кожу для получения кожно-фасциального кармана. Раны обрабатывали 3% раствором перекиси водорода, осушали. Затем раны инфицировали путем внесения в полученный кожно-фасциальный карман суспензии бактериальной ассоциации контрольных (референтных) штаммов Enterobacteriaceae – E. coli ATCC 25922, Staphylococcus spp. – S. aureus ATCC 29212 (ATCC – American Type Cultures Collection). Суспензию изготовляли, используя чистую суточную культуру, выросшую на плотной питательной среде.

Критериями эффективности разработанных раневых покрытий служили скорость заживления, сроки полного заживления и гистоморфологическая картина ран на 5, 10, 15 и 20-е сутки.

Скорость заживления ран оценивали планиметрическим методом по . При контрольных измерениях на рану накладывали стерильную пленку целлофана и на нее наносили контуры раны. Рисунок переносили на миллиметровую бумагу и подсчитывали площадь.

Методы статистической обработки данных. Все количественные результаты исследований были подвергнуты статистической обработке. Статистическую значимость различий в сравниваемых выборках оценивали при помощи t-критерия Стьюдента, статистически достоверными считали различия при р≤0,05 (, 1990).

Накопление базы данных и её информационно-аналитическую переработку, вычислительные операции и графическое изображение результатов исследований осуществляли на компьютере с использованием электронных таблиц Microsoft Excel 2010 для Windows 7.

Результаты и их обсуждение

1. Биоактивные свойства нанопрепаратов

Получение модифицированного серебром монтмориллонита. В качестве исходного материала для получения Ag-MMT использовали монтмориллонит-содержащую глину Белгородского месторождения со следующим минералогическим составом: монтмориллонит, илеит, каолинит, кварц, мусковит, кальцит и полевые шпаты. Нативный ММТ данного месторождения является натрий-кальциевым (Na-Ca-MMT), то есть в межпакетном пространстве силиката содержатся катионы Na+ и Ca2+.

Синтез Ag-MMT производили методом химической обработки нативного силиката модифицирующим агентом – раствором AgNO3. Для проведения дальнейших исследований образцы нативного и модифицированного ММТ измельчили на механической мельнице до получения порошкообразных фракций различной дисперсности (D<0,25 мм и D 0,5–0,25 мм).

Изучение химического состава и морфологии модифицированного серебром монтмориллонита. По результатам рентгенофлуоресцентной спектроскопии (РФС), представленным на рисунке 1, установлен химический состав нативного и модифицированного монтмориллонита. Установлено, что содержание серебра (в составе Ag2O) в модифицированной форме достигает около 20,72% массы, а содержащийся в нативной форме натрий практически отсутствует, что объясняется процессом катионного обмена.

Рисунок 1 – Химический состав образцов нативного (Na-Са-MMT) и модифицированного серебром монтмориллонита (Ag-MMT), %

По результатам электронной микроскопии образцов Ag-MMT отмечено, что образующиеся в процессе катионного обмена AgNPs локализуются как в межслоевом (межпакетном) пространстве алюмосиликата, так и на его поверхности. Указанная структурная особенность, обусловленная слоистой морфологией ММТ, препятствуют агрегации наночастиц и образованию малоактивных конгломератов. Установлено, что AgNPs имеют кубическую, призматическую и сфероидную форму. Размеры визуализирующихся наночастиц колеблется в пределах от 20 до 70 нм.

Сравнительная оценка антимикробной активности модифицированного серебром монтмориллонита и традиционных антисептиков. По результатам оценки антимикробной активности, представленным на рисунке 2, определены минимальные бактерицидные концентрации (МБК) водных взвесей Ag-MMT различной дисперсности D<0,25 мм и D 0,5–0,25 мм. Критерием эффективности бактерицидного действия водных взвесей модифицированного ММТ считали показатели Кред ³ 5 и подавление роста КОЕ более 99,99%.

В частности установлено, что частицы с высокой дисперсностью (D<0,25 мм) проявляют оптимальную бактерицидную активность при концентрациях от 0,025 г/мл. Для частиц с низкой дисперсностью (D 0,5–0,25 мм) бактерицидный эффект обнаруживался при концентрациях более 0,05 г/мл. Выявленную закономерность можно объяснить более активным выходом активного ионизированного серебра (Ag+) в водной взвеси частиц более Ag-MMT высокой дисперсности.

Рисунок 2 – Бактерицидное действие водных взвесей Ag-MMT с различной концентрацией и дисперсностью частиц

При анализе показателей Кред тест-штаммов микроорганизмов при применении водных взвесей Ag-ММТ (D < 0,25 мм) и ряда традиционных антисептиков, представленных в таблице 2, установлено, что Ag-MMT обладал наиболее высокой антимикробной активностью в концентрации 0,05 г/мл. Значения Кред по отношению к штаммам E. coli, P. aeruginosa практически равнялось lgN0. Аналогичные результаты бактерицидной активности получены для 1% раствора диоксидина, однако выявлено снижение его эффективности в отношении E. coli и значимо низкое подавление роста MRSA.

Наименее эффективным оказался 5% раствор повиаргола, что, по-видимому, связано с отсутствием оптимального выхода активных ионов серебра в раствор вследствие образования оксидных пленок на поверхности, составляющего основу препарата диспергированного металлического серебра.

Сравнительная оценка биоцидной активности традиционных антисептиков и водных взвесей высокодисперсного (D<0,25 мм) модифицированного ММТ различной концентрации выявила значимую эффективность последних.

Таким образом, полученная форма модифицированного серебром монтмориллонита, является источником Ag+ и обладает выраженной антимикробной активностью. Для иммобилизации на раневые покрытия в качестве антимикробного компонента наиболее эффективным является использование Ag-MMT с дисперсностью частиц не более 0,25 мм и в минимальной концентрации 0,025 г/мл с пересчетом на массу матрицы-носителя и учетом ее сорбционной способности (набуханию) в водной среде.

Таблица 2

Показатели коэффициента редукции тест-штаммов микроорганизмов при применении водных взвесей Ag-ММТ (D < 0,25 мм) и традиционных антисептиков

Препарат	Коэффициент редукции (Кред) в отношении соответствующего тест-штамма
E. coli ATCC 25922	S. aureus ATCC 29212	P. aeruginosa ATCC 27853	MRSA 474 ВПХ
Контроль lgN0=8,87	Контроль lgN0=9,38	Контроль lgN0=9,24	Контроль lgN0=9,17
Диоксидин 1%	5,83	9,18	9,24	2,91
Катапол 0,5%	5,77	6,62	6,61	3,50
Повиаргол 5%	4,98	4,88	4,89	4,50
Ag-MMT 0,025 г/мл	6,32	7,34	7,58	6,98
Ag-MMT 0,05 г/мл	8,87	9,38	9,24	9,17

Антиоксидантная активность фуллеренола. Совместно с изучено влияние 0,01%, 0,05% и 0,25% растворов фуллеренола (С60(ОН)n) на продукцию супероксидного аниона перитонеальными макрофагами. Результаты исследования свидетельствуют об антиоксидантной активности С60(ОН)n, возрастающей пропорционально уменьшению его концентрации в растворе.

Как видно из таблицы 3, показатели спонтанной хемилюминесценции макрофагов в присутствии 0,05% раствора С60(ОН)n снизились по сравнению с контролем в среднем на 1/3: до 62,43±5,98% (S) и до 68,51±17,34% (Аmax), а после стимуляции зимозаном – на 5–10%: до 78,71±16,65% и 95,80±17,09% соответственно. При добавлении к клеткам 0,01% раствора С60(ОН)n их хемилюминесценция стала ещё менее интенсивной. Светосумма спонтанного свечения уменьшилась в среднем на 62% (до 37,47±5,53%), а его максимальная амплитуда – почти в 2 раза (до 49,87±14,73%). При той же концентрации препарата на фоне «кислородного взрыва» в среде стимулированных макрофагов, регистрируемые показатели снизились соответственно на 30% (до 67,39±15,94%) и на 17% (до 82,33±7,59%). В растворах с 0,25% содержанием С60(ОН)n хемилюминесцентные ответы достоверно не отличались от таковых в контроле.

Таблица 3

Влияние фуллеренола на люцигенинзависимую хемилюминесценцию перитонеальных макрофагов (n=20)

Концентрация растворов фуллеренола	ХЛсп (n1=10)	ХЛстим (n2=10)
S*	Аmax*	S*	Аmax*
0,01%	37,47±5,53**	49,87±14,73**	67,39±15,94	82,33±7,59
0,05%	62,43±5,98**	68,51±17,34	78,71±16,65	95,80±17,09
0,25%	106,33±19,16	85,26±15,93	89,41±19,01	119,84±15,57

Примечание: * - в % от контроля (без препаратов), где величину данного показателя принимали за 100%; ** – различия достоверны при р<0,05 по сравнению с контролем