Патогенетическое обоснование местного применения в биоактивных раневых покрытиях модифицированного серебром монтмориллонита и водорастворимой формы фуллерена с60 (фуллеренола) (стр. 1 )

На правах рукописи

Касанов

Кирилл Николаевич

Патогенетическое обоснование местного применения в биоактивных раневых покрытиях модифицированного серебром монтмориллонита

и водорастворимой формы фуллерена С60 (фуллеренола) (экспериментальное исследование)

14.03.03 – патологическая физиология

14.01.17 – хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург

2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном военном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени » Министерства обороны Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор

доктор медицинских наук доцент

Официальные оппоненты:

– доктор медицинских наук профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика » Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры патофизиологии с курсом клинической патофизиологии

– доктор медицинских наук профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени » Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры факультетской хирургии имени

Ведущая организация:

Государственное бюджетное учреждение «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт скорой помощи имени »

Защита диссертации состоится 24 декабря 2013 года в 12-00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.03 на базе ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. » МО РФ ( Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. » МО РФ

Автореферат разослан «___» ___________ 2013 г.

Учёный секретарь совета

доктор медицинских наук профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

актуальность. В практике врача любой хирургической специальности лечение ран различной этиологии является одним из ключевых направлений повседневной клинической деятельности ( Н, , 2011). Знание закономерностей течения раневого процесса, основных звеньев его патогенеза позволяет своевременно определить тактику ведения раны, предупредить развитие осложнений и, в конечном счете, сократить сроки заживления (Шанин В. Ю., 1998).

На сегодняшний день применение современных биоактивных раневых покрытий, представляющих собой отдельный класс средств местного лечения ран, позволило значительно оптимизировать оказание квалифицированной медицинской помощи (, 2005). Высокая частота природных и техногенных катастроф, локальных вооруженных конфликтов, сопровождающихся возникновением тяжелой механической травмы, огнестрельных пулевых и минно-взрывных ранений определяет актуальность применения раневых покрытий для этой категории пострадавших (, , 2009; , ,   с соавт., 2013; , , 1991).

Ведущими патогенетическими направлениями фармакологического воздействия раневых покрытий являются профилактика и борьба с раневой инфекцией, а также подавление каскада окислительных реакций, зачастую способствующих вторичной деструкции тканей ( , , 2003; , 2013).

По данным многочисленных публикаций, наиболее перспективными для иммобилизации на раневые покрытия в качестве антимикробного компонента являются наноразмерные частицы серебра (AgNPs – Argentum Nano Particles), обеспечивающие дозированный и пролонгированный антимикробный эффект (Fong J., Wood F., 2006; Furno F. et al., 2004; Ip M., Lui S.L., Poon V.K., Lung I., 2006; Morones J.R., Elechiguerra J.L., Camacho A. et al., 2005; Rai M., Yadav A., Gade A., 2009; Taylor P.L., Ussher A.L., Burrell R.E., 2005).

По данным работ (2009), (2011) и с соавт. (2013) о биологической активности кластеров фуллерена С60 на различных растворителях (ПВП, Tween 80, краун-эфире) установлены антиоксидантные, антирадикальные и иммуномодулирующие эффекты местного применения данного препарата. Иммобилизация водорастворимой формы фуллерена С60 (фуллеренола) на раневых покрытиях позволит, сохранив активные биологические свойства углеродных наночастиц, избежать нежелательного использования токсичных растворителей.

В свете вышесказанного, разработка и внедрение современных раневых покрытий, содержащих комплекс патогенетически обоснованных биоактивных препаратов, позволяющих оптимизировать течение раневого процесса, является актуальной задачей стоящей перед врачами-хирургами и производителями (, 2013; , 2013).

Цель исследования: патогенетическое обоснование и экспериментальное изучение эффективности местного применения модифицированного серебром монтмориллонита и водорастворимой формы фуллерена С60 (фуллеренола) при раневом процессе, а также разработка на их основе биоактивных раневых покрытий для лечения ран различной этиологии.

Задачи исследования:

1. Изучить химический состав и морфологию модифицированного серебром монтмориллонита, а также провести сравнительную оценку его антимикробной активности с традиционными антисептиками;

2. В эксперименте на животных изучить антиоксидантную активность водных растворов фуллеренола и исследовать морфофункциональные изменения в тканях внутренних органов, метаболические сдвиги и реакцию системы кроветворения при его парентеральном (внутрибрюшинном) введении;

3. Обосновать с патогенетических позиций местное применение лечебного комплекса нанопрепаратов – модифицированного серебром монтмориллонита и водорастворимой формы фуллерена С60 (фуллеренола), как антимикробного и антиоксидантного компонентов биоактивных раневых покрытий;

4. Разработать биосовместимые сорбирующие матрицы раневых покрытий на основе гидрогелевого нанокомпозита и дезинтегрированной целлюлозы Gluconacetobacter xylinus;

5. Разработать биоактивные раневые покрытия с антиоксидантным и пролонгированным антимикробным действием для лечения ран различной этиологии и оценить эффективность их местного применения на модели инфицированных кожно-плоскостных и гранулирующих ран после глубоких ожогов.

Научная новизна исследования. Впервые дано патогенетическое обоснование местного применения комплекса нанопрепаратов (модифицированного серебром монтмориллонита и фуллеренола) при раневом процессе. Иммобилизация указанного комплекса на полимерные матрицы, позволило получить современные биоактивные раневые покрытия для лечения ран различной этиологии. Разработаны полимерсиликатные композитные матрицы раневых покрытий на основе акриламидного гидрогеля и дезинтегрированной бактериальной целлюлозы (G. xylinus). В качестве наполнителя-модификатора полимерных матриц использовали слоистый силикат монтмориллонит (модифицированную серебром форму), что позволило значительно оптимизировать их механические свойства и сорбционную способность, а также за счет дозированного выхода активных ионов серебра обеспечить пролонгированное антимикробное действие покрытий.

На большом экспериментальном материале (160 крыс-самцов линии Wistar) продемонстрирована способность разработанных раневых покрытий подавлять рост бактериальной микрофлоры в инфицированной ране, а также доказана эффективность их местного применения для лечения инфицированных кожно-плоскостных и гранулирующих ран после глубоких ожогов.

Показано, что для ведения ран, характеризующихся обильной экссудацией наиболее оптимально подходит биоактивное раневое покрытие на основе гидрогелевого нанокомпозита. Биоактивное раневое покрытие на основе дезинтегрированной бактериальной целлюлозы эффективно для лечения инфицированных ран с умеренным количеством отделяемого.

Теоретическая и практическая значимость. С использованием широкого спектра высокотехнологичных лабораторных методов (электронной микроскопии, РФ - и EDS- спектрометрии) изучены химический состава и морфология модифицированного серебром монтмориллонита (Ag-MMT). По результатам микробиологического исследования установлена значимая в сравнении с традиционными антисептиками биоцидная активность Ag-MMT, обусловленная содержащимися в его структуре наночастицами серебра (AgNPs).

В серии экспериментов на животных (100 крыс-самцов линии Wistar) изучены биоактивные свойства водорастворимой формы фуллерена С60 (фуллеренола). Путём определения супероксидпродуцирующей активности тканевых макрофагов выявлены антиоксидантные свойства фуллеренола, оптимально проявляющиеся в его водном растворе с концентрацией 0,01%. Исследование общерезорбтивных свойств фуллеренола показало отсутствие морфофункциональных изменений тканей внутренних органов, патологических сдвигов в системе кроветворения и метаболизме при его внутрибрюшинном введении, в той или иной степени характерных для водорастворимых кластеров фуллерена С60/ПВП и С60/Tween 80.

Разработаны биоактивные раневые покрытия, с высокой и умеренной сорбционной способностью, обладающие антиоксидантной и пролонгированной антимикробной активностью, местное применение которых оптимизирует раневой процесс, предотвращает его осложнённое течение и сокращает сроки заживления ран. Биоактивные раневые покрытия могут быть использованы при оказании медицинской помощи на догоспитальном и госпитальном этапах для местного лечения неогнестрельных и огнестрельных ран, ран при тяжелой механической травме, неинфицированных и инфицированных ран, в том числе гнойных и длительно незаживающих, гранулирующих ран после глубоких термических ожогов, в комплексном лечении трофических язв и пролежней.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Модифицированный монтмориллонит, за счет образования в его структуре наночастиц серебра, обладает выраженной биоцидной активностью в отношении референтных и госпитальных штаммов микроорганизмов, основных возбудителей раневой инфекции, при концентрации его высокодисперсной водной взвеси 0,05 г/мл. Введение монтмориллонита в качестве антимикробного наполнителя матриц раневых покрытий на основе гидрогелевого нанокомпозита (2 мас.%) и дезинтегрированной целлюлозы G. xylinus (0,2 мас.%) позволяет получать значимый бактериостатический эффект in vitro, и поддерживать уровень бактериального обсеменения раны ниже 103(КОЕ) на протяжении 5-7 суток in vivo.

2. Водорастворимая форма фуллерена С60 (фуллеренол) проявляет антиоксидантную активность, в водных растворах с 0,01%-м содержанием углеродных наночастиц. Парентеральное введение фуллеренола не проявляет острой токсичности, не влияет на морфофункциональное состояние внутренних органов, метаболизм и не вызывает патологической реакции системы кроветворения.

3. Биоактивные раневые покрытия на основе гидрогелевого нанокомпозита и дезинтегрированной целлюлозы G. xylinus с иммобилизованными в их составе биоактивными компонентами (модифицированного серебром монтмориллонита и фуллеренола) являются эффективным средством местного лечения инфицированных кожно-плоскостных и гранулирующих ран при глубоких ожогах. Их применение предупреждает осложнённое течение раневого процесса и сокращает сроки заживления ран в среднем на 20%.

Реализация результатов исследования. Результаты исследований используются в научно-исследовательской работе кафедр патологической физиологии и военно-полевой хирургии, а также научно-исследовательской лаборатории военной хирургии ВМедА им. . Материалы исследования использованы при написании монографии «Раневой процесс: нанобиотехнологии оптимизации» (2013).

Получен патент на изобретение: «Раневое покрытие с лечебным действием» (№ 000 от 01.01.2001 г.), получены приоритетные справки по заявкам на изобретения: «Биоактивное гидрогелевое раневое покрытие» ( от 01.01.2001) и «Сетчатое биоактивное раневое покрытие» ( от 01.01.2001).

Публикации. Основные материалы диссертационного исследования опубликованы в 30 печатных работах в виде научных статей, тезисов докладов и глав монографии, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Апробация работы. Основные положения диссертационного исследования изложены в докладах на Итоговых конференциях Военно-научного общества курсантов и слушателей ВМедА 2008, 2009, 2010, 2011, 2012 (II место на конкурсе научных работ), 2013 годов, III Международной научной конференции «Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья» (Белгород, 2008), Международных научно-практических конференциях «XXXVIII, XXXIX, XL, XLI недели науки СПбГПУ» (Санкт-Петербург, 2009, 2010, 2011, 2012), Всероссийском форуме «Изобретатели и инновационная политика России» (Санкт-Петербург, 2011), I и II Всероссийском конгрессе молодых ученых (Санкт-Петербург, 2012, 2013), VIII Санкт-Петербургской конференции молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 2012), I Российской конференции по медицинской химии (MedChem Russia) с международным участием (Москва, 2013).

Результаты работы представлены в виде постерных докладов на X Московском Международном Салоне инноваций и инвестиций (Москва, 2010), Всероссийском форуме студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и инновации в технических университетах» (Санкт-Петербург, 2012), Международной выставке-конференции «БИОИНДУСТРИЯ 2013» (Санкт-Петербург, 2013).

Личный вклад автора в получение результатов, выносимых на защиту, является определяющим. Автор принимал непосредственное участие в выполнении основного объема экспериментальных и лабораторных исследований, изложенных в диссертационной работе, с использованием микробиологических, биохимических и морфологических методов, а также анализ, статистическую обработку и оформление результатов в виде публикаций и научных докладов.

Связь с планом основных научных работ Военно-медицинской академии. Материалы диссертации легли в основу плановой НИР «Разработка на основе нанобиокомпонентов биоактивного раневого покрытия для лечения огнестрельных ран в лечебно-профилактических учреждениях Министерства обороны РФ», шифр «Покрытие», VMA.02.05.06.1113/0167, по заказу ГВМУ МО РФ.

Объём и структура работы. Материалы диссертационного исследования представлены на 150 странице машинописного текста. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа содержит 45 рисунков и 15 таблиц. Список литературы включает 205 источник, из них 98 отечественных и 107 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Лабораторные исследования. Разработка, синтез и изучение химического состава модифицированного серебром монтмориллонита осуществлена в лабораторных условиях кафедры общей химии БелГУ (Белгород). Химический состав Ag-MMT определяли рентгенофлуоресцентным методом на спектрометре «ARL Optim’X». Морфологию образцов силиката изучали с помощью сканирующего электронного микроскопа «SUPRA 55VP-32-49 с EDS - спектрометром».

Разработка гидрогелевой матрицы раневого покрытия на основе сополимера акриловой кислоты и акриламида, способов введения в ее состав природного и модифицированного MMT, а так же сравнительное изучение сорбционной активности, механических свойств полученных нанокомпозитов выполнено в лабораторных условиях кафедры информационных технологий топливно-энергетического комплекса СпбИТМО (Санкт-Петербург).

Синтез, дезинтеграцию и исследование сорбционных свойств целлюлозы G. xylinus, а также получение на ее основе композитного сетчатого раневого покрытия выполнены на базе ИВС РАН (Санкт-Петербург).

Выход активного ионизированного серебра из матриц раневых покрытий устанавливали методом ионометрии. Изначально определяли значение pAg раствора (по аналогии с рН), с последующим пересчетом концентрации Ag+ в моль/мл.

Микробиологические исследования. Определение минимальной бактерицидной концентрации (МБК) Ag-MMT проводили чашечно-суспезионным методом. Критерием эффективности антисептика при этом служил коэффициент снижения числа тест-микроорганизмов – Кред (коэффициент редукции). Оптимальной считали эффективность антисептиков при Кред ³ 5 и подавлении роста не менее 99,99% колониеобразующих единиц (КОЕ) соответствующих микроорганизмов. Исследование проводили на контрольных (референтных) штаммах микроорганизмов E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC 29212 и MRSA.

Бактериостатическое действие разработанных матриц раневых покрытий, а также определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) Ag-MMT в их составе определяли с использованием указанных выше референтных и, дополнительно, госпитальных штаммах P. аeruginosa, Klebsiella pneumoniae и MRSA, полученных в клинике военно-полевой хирургии ВМедА им. .

Способность разработанных матриц раневых покрытий подавлять рост микрофлоры в инфицированной ране определяли на модели инфицированной раны, воспроизведенной на 20 крысах. Критерием эффективности матриц в подавлении роста раневой микрофлоры являлось снижение показателя ориентировочной микробной обсемененности и макроскопическая картина ран.

Биохимические исследования. Супероксидпродуцирующую способность тканевых макрофагов исследовали методом хемилюминесценции с помощью регистрации спонтанной хемилюминесценции (ХЛсп) клеток, определяя уровень продукции фагоцитами реактивных форм кислорода, прежде всего, супероксидного анион-радикала (О2•). В эксперименте использовали альвеолярные и перитонеальные макрофаги. По интенсивности наработки О2• оценивали степень активности клетки и её функциональный потенциал при применении препарата.

Биохимические и клеточные показатели крови у крыс определяли по стандартным методикам. Условную норму отрабатывали на 10 белых крысах-самцах линии Wistar. Экспериментальным группам внутрибрюшинно вводили 1 мл 0,01% водного раствора фуллеренола. Кровь забирали путём каудальной ампутации в нижней трети хвоста на 4 и 9 сутки (по 10 животных в каждой группе). Полученные результаты сравнивали с данными референтных показателей крови у крыс линии Wistar представленными в «Diseases of the Wistar Rat» (1997).

Морфологические исследования. Морфологические методы использовали для определения морфофункциональных изменений в тканях внутренних органов животных при выполнении сравнительной оценки общерезорбтивного действия фуллеренола и других водорастворимых кластеров фуллерена С60 при их парентеральном (внутрибрюшинном) введении. Для проведения гистоморфологических изменений у всех животных (n=30) на момент выведения из опыта производили забор тканей сердца, лёгких, печени, селезёнки, почек и тонкой кишки с брыжейкой. Препараты изучали методом световой микроскопии.

Экспериментальные исследования. Общее количество животных, использованных в экспериментальной части работы, составило 290 крыс-самцов линии Wistar массой 180–230 г (таблица 1), полученных из питомника РАМН «Раполово».

Эксперименты на крысах выполняли под эфирным наркозом (полуоткрытый контур). Крыс выводили из опыта путём декапитации или передозировкой эфирного наркоза. После операций животные находились под динамическим наблюдением в условиях вивария. Содержание животных осуществляли в соответствии с «Правилами проведения научных исследований с использованием экспериментальных животных» (1980) и с приказом МО РФ от 01.01.01 г. № 267 «Об утверждении правил лабораторной практики».

Результаты экспериментов оценивали по клиническому течению послеоперационного периода (активность, поведение, отношение к пище, мочеотделение, состояние послеоперационной раны).

Таблица 1