Мембранные белки: характеристика и структурные принципы (стр. 4 )

Рис. 3.7. Карта электронной плотности и трехмерная структура бактериородопсина, полученная методом реконструкции изображения. (Из работы [428].)

Разрешения метода реконструкции изображения недостаточно для того, чтобы проследить за ходом полипептидной цепи, и участки, соединяющие семь предполагаемых спиралей, в основном не видны. С 1980 г. было построено много моделей структуры бактериородопсина, согласующихся с дифракционными данными [386, 387, 1108, 731, 5, 1468], а также предприняты многочисленные попытки получить необходимую информацию с помощью других методов. До настоящего времени наиболее часто использовались: 1) определение аминокислотной последовательности [354, 745, 1107]; 2) протеолиз и иммунологические методы для выявления тех участков белка, которые находятся за пределами бислоя, и установления их ориентации относительно внутренней и наружной сторон мембраны [506, 1536, 753, 1108, 1110].

Все построенные модели сходны в интерпретации общей укладки и топологии молекулы. На рис. 3.8 представлена модель [355], аналогичная предложенной Энгелманом и др. [385]. Установлено, что для пересечения неполярной части бислоя (-33 А) спираль должна содержать 21 аминокислотный остаток, и в белковой молекуле действительно имеется семь участков примерно такой длины с преобладающим содержанием неполярных аминокислот. Полагают, что они и образуют семь а-спиралей, наблюдаемых на карте электронной плотности. Эти а-спирали обычно обозначаются буквами А, В, С,

Рис. 3.8. Одна из моделей расположения в мембране бактериородопсина. Буквами А—G обозначены семь спиралей, начиная с N-конца. Участок связывания ретиналя изображен в соответствии с данными работы [662]. Модель сходна с предложенной Энгелманом и др. [385]. (Из работы [355] )

D, E, F, G, начиная с N-конца. Каково соответствие между ними и семью спиралями, выявленными с помощью электронно-микроскопических исследований (рис. 3.7), — неизвестно. Этот вопрос неоднократно обсуждался, и здесь существуют разные мнения. Почти не вызывает сомнений, что общая топология, представленная на рис. 3.8, адекватна [1468]. Разные модели, описанные в литературе, в каких-то отношениях могут существенно различаться. Это касается, в частности, длины нескольких спиралей, расположенных внутри бислоя, которая варьирует в разных моделях в пределах 10 остатков. Несмотря на эти разногласия, по главным особенностям достигнут консенсус, хотя говорить о единодушии нельзя. Эти особенности следующие.

1. Участки белка, пересекающие бислой, имеют форму а-спира-лей и в целом неполярны. Спирали, вероятно, пронизывают всю толщу, мембраныА), а не только неполярную часть бислоя (~ЗЗА). Спирали перпендикулярны (или почти перпендикулярны) поверхности мембраны и. упакованы так, что расстояние между их центрами составляет 10 А.

2. Заряженные и полярные аминокислотные остатки расположены в основном в участках, соединяющих трансмембранные спирали. В той части белковой молекулы, которая погружена в неполярнуючасть бислоя, имеется до девяти ионизируемых остатков в зависимости от того, где расположены его границы. По-видимому, для стабилизации стркутуры они должны быть каким-то образом нейтрализованы (разд. 3.6.3). Возможно, они образуют ионные или водородные связи с остатками, расположенными в другой части полипептидной цепи. Этот момент может оказаться полезным при обсуждении вопроса о характере упаковки разных спиралей в мембране [387]. По-видимому, ионизируемые остатки, располагающиеся внутри мембраны, имеют структурное и/или функциональное значение. Пример тому — остаток Lys-216, с которым связывается ретиналь. Большинство заряженных аминокислотных остатков, локализованных в экспонированных в раствор участках белка, располагаются вблизи цитоплазматической поверхности или непосредственно на ней.

3. Примерно в середине спиралей В, С и F расположены по три остатка пролина (Рго-50, 91, 186), однако спирали при этом не выглядят сильно изогнутыми.

4. Наблюдается асимметричное распределение ароматических аминокислот: многие остатки тирозина и почти все остатки триптофана находятся вблизи наружной стороны мембраны. Значение этого феномена неизвестно.

5. N-Конец располагается у наружной стороны мембраны, а С-конец — у внутренней.

6. С-Концевой участок, по-видимому, имеет форму статистического клубка (судя по данным КД) и может подвергаться протеолизу без нарушения функций белка [853, 1541].

7. Лизин-216 связан с простетической группой — ретиналем и расположен примерно в середине спирали G [715, 756].

Вывернутый белок

Относительно структуры бактериородопсина можно сделать весьма интересный вывод: его полипептидная цепь уложена так, что полярные или заряженные остатки, находящиеся в семи трансмембранных участках, оказываются обращенными внутрь глобулы, а неполярные контактируют с мембранными липидами. Глобула по существу «вывернута» [386], если сравнивать ее с белками, в которых большинство неполярных остатков спрятаны внутри структуры, а полярные обращены наружу. Этому есть разумное объяснение, и об этом же свидетельствуют некоторые экспериментальные данные, в первую очередь данные по рассеянию нейтронов. В основе упомянутого метода лежит существенное различие между рассеянием на атомах водорода и дейтерия. Дейтерированные валин и фенилаланин включали путем биосинтеза в бактериородопсин и затем, используя разностный метод Фурье, устанавливали распределение этих амино-кислот в проецируемой структуре пурпурной мембраны. Приняв общепринятые допущения о последовательности предполагаемых спиральных участков, при построении соответствующей модели обнаружили, что если смотреть вдоль оси спирали, то для каждой спирали (А—G) остатки валина будут располагаться на сторонах, противоположных заряженным и полярным группам, а остатки фенилалани-на — преимущественно на противоположной валину стороне. По данным нейтронного рассеяния, остатки валина преимущественно обращены к мембранным липидам, поэтому был сделан вывод, что заряженные и полярные остатки группируются внутри белка. Заметьте, что этот результат не зависит от конкретного расположения участков полипептида на электронно-микроскопической карте.

Другой подход основан на использовании гидрофобного фотореактивного зонда 1251-ТИД (табл. 4.1). Этот реагент внедряется в гидрофобную сердцевину мембраны и при фотолизе неспецифически реагирует с наиболее доступными боковыми группами аминокислот. Это его свойство может использоваться для локализации тех участков белковой молекулы, которые обращены к липидам. По крайней мере в двух случаях, в том числе в случае бактериородопсина, отмечалось включение метки в специфические, периодически расположенные участки полипептидной цепи [653, 157], при этом метка включалась через каждые три или четыре остатка. Если такой характер ме-чения отражает только долю боковых групп, обращенных к

Рис. 3.9. Графическое представление амфифильных спиралей, вид вдоль оси спирали. А. Спираль С бактериородопсина (спиральное кольцо); гидрофильные остатки заключены в прямоугольные рамки. (Из работы [47].) Б. Векторное представление вкладов в гидрофобный момент, который дают остатки мелиттина с 5 по 22, составляющие амфифильный сегмент. Каждый остаток представлен вектором, длина которого пропорциональна гидрофобности этого остатка. Гидрофобность трех заряженных остатков (Lys, Lys и Arg) отрицательна; им соответствуют пунктирные векторы. Гидрофобный момент всего сегмента равен сумме векторов. (Из работы [375].)мембранным липидам, то мы сможем установить, какая сторона предполагаемого а-спирального участка контактирует с липидами. Поскольку на один виток спирали приходится 3,6 остатка, то наблюдаемая периодичность может иметь место только в том случае, если зонд контактирует лишь с одной стороной спирали. Данные по спирали С (рис. 3.9) в бактериородопсине согласуются с представлением о вывернутой структуре этого белка и тоже свидетельствуют о том, что соответствующая часть полипептида имеет спиральную конфигурацию. В целом можно сказать, что концепция вывернутых интегральных мембранных белков весьма разумна, однако экспериментальное ее обоснование пока недостаточно. Напомним, что, согласно моделям фотосинтетического реакционного центра, в сердцевине би-слоя находится очень мало ионизируемых остатков (разд. 3.5.1) или они отсутствуют там вообще.

Расположение спиралей в бислое и их соединение

Ситуация, которая сложилась при изучении бактериородопсина, весьма необычна в том смысле, что при промежуточном уровне разрешения удается установить некоторые структурные детали, но этого разрешения недостаточно для однозначного определения конфигурации белка в бислое. Все попытки, которые предпринимались здесь до сих пор, скорее смогли выявить ограничения использовавшихся методов, чем выяснить принципы структурной организации мембранных белков. Применялись следующие методы.

1. Теоретический анализ, направленный на поиск такой конфигурации спиральных участков, при которой происходит оптимальная нейтрализация зарядов благодаря образованию ионных связей внутри бислоя, а также на оценку длины полипептидных участков, соединяющих спирали [386].

2. Нейтронное рассеяние с использованием дейтерированных аминокислот и данных об аминокислотном составе каждого спирального участка [5].

3. Улучшение разрешения в плоскости мембраны с использованием метода. реконструкции изображения и электронной дифракции [731].

4. Определение рентгеновского рассеяния до и после протеолити-ческого расщепления N-концевого пептида с целью идентификации на карте электронной плотности остатков, расположенных на N-koh-це [1542].

5. Исследование с помощью нейтронного рассеяния бактериородопсина, реконструированного из протеолитических фрагментов, один из которых был дейтерирован [1468].

6. Нейтронное рассеяние с использованием дейтерированного ре-тиналя, включенного либо путем замещения [756], либо биосинтети-чески [715, 1324]. Ретиналь был присоединен к Lys-216 в спирали G. Считается, что он расположен внутри бислоя под углом 75° по отношению к нормали (данные по линейному дихроизму), т. е. почти параллельно поверхности мембраны [628].

7. Фотохимическое сшивание с использованием фотореактивного производного ретиналя [662]. Этот метод позволяет выявить ближние взаимодействия.

Каждый из этих подходов имеет свои ограничения, и в этом смысле они не согласуются между собой. Существует 5040 (7!) возможных способов размещения семи спиралей (А—G) в семи бороздках (1—7), и до настоящего времени эти методы давали противоречивые ответы на вопрос даже о наиболее вероятном их расположении.

3.5.3. СТРУКТУРА ПОРИНОВ

Порины — это основной класс белков, обнаруженных в наружной мембране кишечных бактерий [1068, 579, 86] (см. также разд. 8.2.3). У Е. coli и Salmonella typhimurium выявлены три порина: OmpF, OmpC и PhoE. Эти белки имеют мол. массу примернои гомологичные аминокислотные последовательности. Порины экстрагируются из наружной мембраны с помощью ДСН в виде стабильных тримеров; их можно встроить в фосфолипидные бислои с образованием неспецифичных пор, способных пропускать малые (<600 Да) гидрофильные молекулы. По-видимому, именно они придают наружной мембране бактерий свойство молекулярного сита, Позволяя питательным веществам проникать внутрь клетки, а отходам — выводиться наружу через неспецифические каналы [1053].

Были проведены обширные структурные исследования белка OmpF, известного также под названием «матриксный порин»; в настоящее время осуществляется кристаллографический анализ, который позволит получить его структуру с высоким разрешением [490]. Однако уже сейчас можно сделать вывод, что структура OmpF сильно отличается от структуры как бактериородопсина, так и полипептидов, образующих фотосинтетический реакционный центр. Судя по данным о первичной последовательности, в молекуле нет никаких длинных гидрофобных участков, которые можно было бы идентифицировать как трансмембранные, и в среднем в ней содержится больше полярных аминокислот, чем неполярных [737, 1129, 1523]. Однако трехмерная электронно-микроскопическая реконструкция изображения с использованием кристаллических пластинок реконструированного порина показала, что белок пронизывает бислой, причем за пределы мембраны выходят лишь небольшие участки молекулы [384]. Методом негативного контрастирования были выявлены каналы, образуемые тримерами. Отдельные молекулы поринаобразуют у внутренней поверхности каналы, которые в середине би-слоя сливаются в одиночный канал, открывающийся наружу [384]. Есть и другие данные, свидетельствующие о том, что порин, несмотря на отсутствие в его молекуле гидрофобных участков, является трансмембранным белком [1129]. Иногда этот белок выполняет роль рецептора для бактериофага (для этого отдельные его участки должны быть экспонированы на наружной поверхности), а также проявляет сродство к компонентам клеточной стенки на периплазма-тической стороне. Очищенный порин можно встраивать в фосфоли-пидные бислои с образованием потенциалчувствительных каналов (см. разд. 8.2.3).

Данные инфракрасной спектроскопии, кругового дихроизма и широкоугольной диффузионной рентгеновской дифракции свидетельствуют о том, что две трети длины молекулы образует /3-слой, а на долю а-спиралей приходится небольшая часть длины молекулы [737, 1129, 1523]. Кроме того, эти исследования показывают, что /3-цепи антипараллельны, ориентированы перпендикулярно плоскости мембраны н имеют среднюю длину 10—12 остатков, которых достаточно для пересечения неполярной области мембраны. Способ укладки /J-цепей можно установить лишь с помощью рентгеновской дифракции. Как показывают модельные исследования, /3-цепи могут быть уложены так, что образуется /3-цилиндр, при этом полярные и заряженные аминокислотные остатки выстилают стенки наполненных водой каналов [1129, 1523] (см. рис. 8.7).

Все известные о структуре порина данные показывают, что гидрофобная а-спираль не является его необходимым трансмембранным элементом. Это означает, что наиболее распространенные способы предсказания структуры трансмембранных белков имеют свои ограничения, поскольку они основываются на предположении, что пересечь бислой могут только гидрофобные сегменты. Точная структура порина до сих пор неизвестна; неясно также, сходна ли она со структурой других мембранных белков. Впрочем, имеются и другие белки наружной мембраны бактерий, которые характеризуются высоким содержанием /3-структур. Один из них — белок ОтрА [1068, 1019], который тоже является рецептором для фагов, но, вероятно, не существует в виде отдельных тримеров и не образует поры. Другой белок такого рода — LamB (мальтопорин), являющийся рецептором бактериофага лямбда; он функционирует как специфичный ка-иал, через который осуществляется диффузия мальтодекстринов ([1292, 1068]; см. также разд. 8.2.3).

Предположение о том, что необычная структура поринов связана с уникальной структурой и составом наружной мембраны бактерий, выглядит правдоподобно. Возможно, однако, что она обусловлена уникальностью способа образования больших водных каналов через бислой (гл. 8).3.6. Принципы структурной организации мембранных белков и способы ее предсказания для трансмембранных белков

Как мы уже говорили, с высоким разрешением удалось установить структуру только одного класса мембранных белков — реакционного центра бактерий, однако и в этом случае положение белка относительно липидного бислоя не определено однозначно. Распространять принципы его организации на другие мембранные белки следует с осторожностью. Некоторую ясность может внести использование термодинамических принципов, а также учет того факта, что основная масса экспериментальных данных согласуется с предположением о высоком содержании в мембранных белках а-спира-лей. Термодинамические факторы налагают определенные органиче-ния на то, какого типа белково-липидные структуры могут быть стабильными.

3.6.1. МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ - ЭТО АМФИФИЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ

Любые мембранные белки, непосредственно контактирующие с гидрофобной сердцевиной липидного бислоя, должны быть амфи-фильными. Те участки полипептида, которые экспонированы в растворитель, скорее всего обогащены полярными и ионизируемыми аминокислотными остатками, а остатки, контактирующие с лилид-ными углеводородными цепями, должны быть в основном неполярными. Все это логически следует из энергетических принципов, рассмотренных в разд. 2.3.1. Заряженные или полярные аминокислоты вообще говоря могут находиться внутри бислоя, однако на это налагаются определенные ограничения (разд. 3.6.2).

Рассмотрим три уровня амфифильных структур в мембранных белках: первичную, вторичную и третичную амфифильность.

1. Первичные амфифильные структуры содержат протяженный участок из преимущественно неполярных аминокислотных остатков, длина которого достаточна для пересечения бислоя. Такие структуры выявлены как в реакционном центре, так и в бактериородопсине. У этих белков все пронизывающие мембрану элементы являются а-спиральными. а-Спиральная структура предпочтительна потому, что при этом образуются все водородные связи, в которых могут участвовать атомы водорода полипептидного каркаса. Альтернативная структура, у которой отсутствует одна из водородных связей, менее стабильна примерно на 5 ккал/моль. Все это позволяет высказать предположение [389] о том, что поворот полипептидной цепи внутри мембраны маловероятен (см. работу [826] в качестве примера такой модели). В местах поворота от трех до пяти аминокислотных остатков не смогли бы образовать водородные связи, и это дестаби-лизировало бы структуру примерно на 15—20 ккал/моль. В глобулярных, водорастворимых белках области поворота располагаются преимущественно на поверхности белковой глобулы, где амидные группы могут образовывать водородные связи с водой; по-видимому, в молекулах мембранных белков повороты также будут происходить лишь в экспонированных в воду участках [1129].

Не исключено, что /3-слой тоже может образовывать трансмембранные элементы, имеющие, например, форму /J-цилиндров, как в случае порина (разд. 3.5.3 и рис. 8.7). Требования, предъявляемые к образованию водородных связей атомами водорода полипептидного остова в подобных структурах, могут быть удовлетворены, но лишь при условии взаимодействия между отдельными /3-цепями. Как такая структура может встраиваться в мембрану, не совсем ясно, а ограничения, налагаемые механизмами сборки мембранных белков, вообще неизвестны (см. разд. 10.3).

2. Вторичные амфифильные структуры. В таких структурах гидрофобные остатки периодически встречаются вдоль цепи, и при укладке полипептида в определенную вторичную структуру они образуют сплошную поверхность. Периодичность некоторых элементов вторичной структуры указана в табл. 3.7. В качестве примера белков, в которых вторичные амфифильные структуры, по-видимому, играют важную роль, можно привести порины. В них полярные и неполярные аминокислотные остатки в каждой из /J-цепей чередуются (рис. 8.7). Все полярные остатки находятся на одной стороне складчатого слоя, выстилая наполненную водой пору. Заметим, что все сказанное о порине носит гипотетический характер.

Таблица 3.7. Параметры вторичной структуры "

а-Спираль, в которой гидрофобные остатки встречаются через каждую вторую или третью мономерную единицу, должна иметь гидрофобную и полярную поверхности. Подобные структуры часто представляют в виде спирального кольца с указанием боковых цепей — так, как это сделано на рис. 3.9 [1294]. Вторичные амфифиль-ные структуры могут возникать в ситуациях, схематически показанных на рис. ЗЛО.

Рис. 3.10. Структурная роль некоторых вторичных амфифильных спиралей, взаимодействующих с липидным бислоем.

а. Поверхностно-активные сегменты белка; одна сторона спирали взаимодействует с гидрофобной областью липидного бислоя, а другая (полярная) контактирует с водной фазой и полярной областью бислоя. Амфифильные а-спирали способны образовывать многие пептидные гормоны, а также разрушающие мембрану пептиды, например меллитин (разд. 3.7).

б. Трансмембранные элементы; неполярная поверхность спирали обращена к липидной фазе, а полярная выстилает водный канал, пронизывающий бислой. Это весьма распространенная модель, построенная главным образом исходя из результатов исследования никотинового ацетилхолинового рецептора, функционирующего как химически возбудимый канал (см. разд. 8.2.4). Однако основанные на экспериментальных данных выводы о том, что мембрану пронизывает именно амфифильная спираль [258, 1623], вызвали возражения [776, 1198]. Такой наполненный водой канал, как в порине, может образовать и амфифильная 0-цепь (рис. 8.7).