Мембранные белки: характеристика и структурные принципы (стр. 6 )

При встраивании в мембрану грамицидин А образует каналы, пропускающие одновалентные катионы ([430]; разд. 8.1.5). Многочисленные исследования с использованием плоских мембран и липосом показали, что канал представляет собой пептидный димер. Было предложено много моделей грамицидинового канала, но адекватной[1564], по-видимому, является модель, впервые предложенная Урри [1484]. Согласно этой модели (рис. 3.13), грамицидин А находится в форме /3(L, О)-спирали [ранее ее называли 7r(L, О)-спиралью], в которой два мономера нековалентно связаны своими N-концами в середине бислоя. Общая длина канала составляет около 30 А, а наружный и внутренний диаметры равны соответственно 15 и 5 А. Все гидрофобные боковые группы находятся снаружи спирали, а гидрофильные карбонильные группы пептидного остова выстилают пору. Из органического растворителя были получены кристаллы грамицидина, чья структура была определена с разрешением 2,5 А методом рентгеновской дифракции [1537]. Однако эта структура, по всей вероятности, отличается от той, которую имеет грамицидин А в мембране.

Рис. 3.13. Схематическое представление канала, образуемого димером грамицидина А в бислое. (Из работы [1564].)

Поскольку в состав грамицидина входят необычные D-аминокис-лоты, его нельзя использовать в качестве модели структур, встречающихся в мембранных белках. Однако этот пептид все же позволяет получить представление об одном из способов образования селективной поры в бислое (см. гл. 8). Грамицидин А — легкодоступный белок, поэтому его часто использовали также в качестве «модельного мембранного белка» при исследовании возмущающего действия мембранных белков на липиды [831]. При достаточно высокой концентрации в мембране (>5 мол.%) грамицидин А агрегирует с образованием тубулярных структур и индуцирует образование гексагональной фазы Нн в модельных мембранах [137].

2. Аламетицин — это пептидный антибиотик из 20 аминокислотных остатков, способный образовывать в мембране электровозбудимые каналы ([1030]; разд. 8.1.5). Аминокислотная последовательность аламетицина приведена ниже и включает необычные остатки — а-аминомасляную кислоту (Aib) и L-фенилаланин (РЫ):

Данные по независимости проводимости алашетициновых каналов в плоских мембранах от концентрации пептида свидетельствуют о том, что каждый канал образован 6—11 мошекулами. Согласно результатам рентгеноструктурного анализа (структура аламетицина была определена с разрешением 1,5 А [45>6]), пептид является в основном а-спиралью с изгибом в середине, на уровне пролина-14. Эта структура содержит цепочку доступных для растворителя полярных атомов, тянущуюся вдоль всей молекулы, что придает ей амфифильный характер. В этой цепочке представлены карбонильные группы остова, подобные полярным группам, образующим полость грамицидинового канала. Фокс и Ричарде [456] построили модель аламетицииового канала, основанную на этой молекулярной конфигурации, оптимизировав взаимодействия между отдельными цепочками и параметры упаковки. Согласно этой модели (рис. 3.14), каждый канал образован олигомерным (-8) кластером молекул, соединенных водородными связями с образованием стабильной структуры, в которой полярные атомы экспонированы в растворитель. Предполагается, что конформационное изменение в этой структуре происходит при возникновении напряжения поперек бислоя, которое стабилизирует «открытую» конформащию канала и обеспечивает электровозбудимое проведение. Длина канала, согласно модели, составляет 32 А, что достаточно для пересечения неполярной части бислоя.

3. Мелиттин (компонент пчелиного яда) [372, 721] в отличие от грамицидина А или аламетицина является водорастворимым пептидом. Он состоит из 20 аминокислот, многие из которых полярны [566]:

1*Ис. 3.14. Предполагаемые структуры, образуемые алшметициновыми олигомерами * липидиом бислое. Показаны три конформации: коиформация в отсутствие наложенного трансмембраниого потенциала (слева), коиформашия открытого канала при наличии потенциала (справа) и промежуточная конформашия (в центре) (см. также разд. 8.1.5, где обсуждаются каналообразующие свойства этого пептида). (Из работы W36J.) Любезно предоставлено д-ром F. Richards.

Мелиттин встраивается в клеточные мембраны, вызывая лизис клеток; он также может образовывать электровозбудимые каналы в плоских мембранах [740]. Мелиттин является «поверхностно-активным» пептидом, который образует монослои на границе раздела воздух—вода. Структура мелиттина была установлена методом рентгеновской кристаллографии. Он существует в двух кристаллических формах [1445]. В обоих случаях это изогнутые а-спирали, аналогичные аламетициновой спирали. Структура обладает ярко выраженной амфифильностью (рис. 3.15) из-за асимметричного распределения полярных боковых цепей. Грамицидин А и аламети-цин также амфифильны, но полярные группы в значительной степени представлены карбонильными группами остова, а не полярными боковыми цепями. Мелиттин, подобно другим пептидам, полиморфен. В водном растворе он существует в виде мономера, в котором, по данным КД, только 7% аминокислотных остатков входят в состав а-спиралей. В водном растворе мелиттин может также образовывать тетрамеры и связываться с мембранами. В двух последних случаях степень спиральности достигает -70% [1522]. Способ связывания мелиттина с мембранами и механизм(ы), с помощью которого он разрушает бислой, недостаточно изучены [1445, 302, 353]. Согласно одной из моделей [1445], разрушение происходит в соответствии с эффектом «клина» [299]: мелиттин связывается с одной стороной бислоя и дестабилизирует ее, повышая площадь поверхности так, как это делают детергенты [614]. Мелиттин может также образовывать электровозбудимые каналы в плоских мембранах [164]. По всей вероятности, способы связывания его с бислоем весьма разнообразны и зависят от экспериментальных условий [283, 353].

Рис. 3.15. Предполагаемая структура мелиттина, связанного с поверхностью фосфати-дилхолинового бислоя. Гидрофобные остатки расположены на нижней поверхности и заряжены, гидрофильные — на верхней. (Из работы [1445].) Любезно предоставлено д-ром D. Eisenberg.4. Пептидные гормоны часто содержат потенциально амфифиль-ные а-спиральные участки, аналогичные соответствующим участкам в мелиттине [721]. Примерами могут служить /3-эндорфин [107], кальцитонин [392], кортикотропин [1506], рилизинг-фактор корти-котропина [821]. Высказывалось предположение, что эти гормоны связываются с мембраной с помощью амфифильных спиралей; при этом вторичная структура пептида, стабилизируемая мембраной, облегчает связывание гормона со специфическим рецептором. Все они являются водорастворимыми пептидами, но обладают сродством к фосфолипидным бислоям. а-Спиральные участки могут располагаться на N-конце (кортикотропин), на С-конце (/3-эндорфин) или в средней части молекулы (рилизинг-фактор кортикотропина). Было показано, что биологическая активность /3-эндорфина обусловлена именно амфифильностью, а не аминокислотным составом спирального участка [107]. Подобные структуры демонстрируют нам один из способов, которыми белковые молекулы могут связываться с мембраной (например, пируватоксидаза) [1206].

3.7.2. МОДЕЛЬНЫЕ СИНТЕТИЧЕСКИЕ ПЕПТИДЫ [721]

Синтетические пептиды можно разделить на два класса:

1) пептиды, которые проявляют первичную амфифильность и могут служить моделью трансмембранной гидрофобной а-спирали; 2) пептиды, обладающие потенциальной вторичной амфифильностью и имеющие форму а-спирали или /3-слоя.

1. Первичные амфифильные пептиды. Проводились исследования [1021], в которых амфифильные пептиды, например Gly-LeuN-Ьувг-Ак-амид, исследовали в комплексах с синтетическими фосфоли-пидами с помощью ЯМР и дифференциальной сканирующей калориметрии. С помощью фазовой диаграммы «температура/состав» для пептидно-липидной смеси проверяли адекватность термодинамических моделей этой бинарной системы. Были сделаны следующие выводы: 1) для объяснения термодинамических свойств пептидов не требуется делать допущение о существовании липидного кольца, связанного с пептидом и изолированного от остальных липидов;

2) неправильные оценки толщины гидрофобного участка липидного бислоя и длины предполагаемого а-спирального пептида не сказываются существенным образом на фазовом поведении системы.

2. Вторичные амфифильные пептиды. Пептидам, способным образовывать амфифильные а-спирали, посвящено множество работ. Моделировались потенциальные а-спиральные участки пептидных гормонов (например, /3-эндорфина [107]), кальцитонина [1001, 392], мелиттина [302] и аполипопротеинов. Липопротеины — это глобулярные белково-липидные комплексы, присутствующие в сыворотке. Аполипопротеины, выделенные из таких комплексов и принадлежа-щие к классам А, С и Е, содержат потенциально амфифильные а-спиральные участки, которые, по всей вероятности, и взаимодействуют с липидами. Некоторые пептиды, синтезированные специально для моделирования амфифильных элементов аполипопротеи-нов, обладают замечательными свойствами [214, 33, 470]. Они способны стабилизировать бислойные диски (диаметром -100 А), связываясь, как полагают, по их краю. Эти дисковидные комплексы напоминают структуры, образуемые аполипопротеиновыми комплексами с фосфолипидами. Другие амфифильные пептиды, например мелиттин [1328, 353] и глюкагон [393], по всей вероятности, также стабилизируют дисковидные частицы или плоские слои липидно-го бислоя. Следует отметить, что разные амфифильные пептиды существенно различаются по характеру взаимодействия с фосфолипидами (они могут связываться с поверхностью, стабилизировать дисковидные комплексы, образовывать трансбислойные каналы, разрушать бислой подобно детергентам). Причина такого разнообразия не установлена.

Были синтезированы также пептиды, образующие амфифильные /3-слои, которые служили моделью поверхностно-активных белков [1103]. Необходимо подчеркнуть, что структура некоторых пептидов в водном растворе может существенно отличаться от структуры, предсказываемой на основании алгоритма Чоу—Фасмана [218], который разрабатывался применительно к глобулярным белкам.

3.8. Мембранные белки, ковалентно связанные с липидами [1322, 260, 875]

Многие мембранные белки эукариот и прокариот ковалентно связаны с липидами, которые присоединяются к полипептиду после трансляции (табл. 3.8). В некоторых случаях эти липиды играют роль гидрофобного «якоря», с помощью которого белок прикрепляется к мембране. В других случаях роль липидов менее очевидна; возможно, они участвуют в процессе миграции белка в соответствующую область клетки или (как в случае белков оболочки вирусов) в слиянии мембран.

В качестве примера наиболее полно охарактеризованного белка прокариот можно привести липопротеин Брауна [591] — основной липопротеин наружной мембраны Е. coli. Зрелая форма этого белка содержит ацилглицерол, связанный тиоэфирной связью с N -концевым цистеином. Кроме того, N-концевая аминогруппа связана с жирной кислотой амидной связью. Мембраносвязанная форма пеницил-линазы из Bacillus licheniformis прикрепляется к цитоплазматической мембране с помощью N-концевого ацилглицерола аналогично липо-протеинам наружной мембраны [811].Таблица 3.8. Некоторые мембранные белки, ковалеитно связанные с липидами

Мембранные белки эукариот часто бывают ковалентно связаны с липидами. Их можно разделить на три класса: 1) белки, связанные с миристиновой кислотой; 2) белки, связанные с пальмитиновой кислотой; 3) белки, связанные с гликозилфосфатидилинозитолом. Белки, связанные с жирными кислотами, по-видимому, локализованы в основном на цитоплазматической поверхности плазматической мембраны [1583], а белки, связанные с фосфатидилинозитолом, — на наружной [184, 418].

Миристиновая кислота присоединяется к белку через амидную связьс N-концевым глицином, причем, вероятно, это происходит одновременно с трансляцией на рибосомах. Не все миристинилирован-ные белки связаны с плазматической мембраной [1583]. Пальмитиновая кислота чаще всего присоединяется к белкам путем образования тиоэфирной связи с цистеином или гидроксиэфирной связи с серином и треонином. Эти аминокислотные остатки обычно расположены внутри основной части полипептида вблизи трансмембранных участков, как правило, на цитоплазматической стороне. Присоединение пальмитиновой кислоты происходит посттрансляционно.

Небольшой класс эукариотических белков плазматической мем-браны присоединяется к наружной поверхности клетки с помощью ковалентно связанного гликофосфолипида — производного фосфати-дилинозитола. Эта связь всегда локализована на С-конце аминокислоты. Фосфолипидный якорь присоединяется посттрансляционно после протеолитического отщепления аминокислот 17—31 от карбоксильного конца молекулы-предшественника. Этот якорь в некоторых случаях является единственным способом прикрепления белка к мембране, поскольку в присутствии фосфолипазы С происходит отсоединение белка от мембраны. Почему эта небольшая группа белков прикрепляется к плазматической мембране именно таким способом — неизвестно.

3.9. Мембранные белки, ковалентно связанные с углеводами [1245, 634]

Поверхностные белки клеток млекопитающих, в том числе большинство рецепторов и транспортных белков, почти всегда гликози-лированы (гл. 8 и 9). Почему это так — неясно. Возможно, это связано с необходимостью сортировки белков при направлении их к плазматической мембране (см. гл. 10). Сахарные остатки могут защищать белок от протеолиза или участвовать в узнавании или адгезии (см. разд. 9.3). Как бы то ни было, ясно, что сахарные остатки в мембранных гликопротеинах локализованы исключительно на наружной стороне мембраны. Имеются также гликопротеины, локализованные в цитозоли [643].

Можно выделить два основных класса олигосахаридных структур мембранных гликопротеинов: 1) N-гликозидные олигосахариды, связанные с белками через амидную группу аспарагина; 2) О-гликозид-ные олигосахариды, связанные через гидроксильные группы серина или треонина (рис. 3.16). Более полно изучен процесс образования N-гликозидных связей (см. гл. 10; [1245, 634]). Этот класс олигосахари-дов состоит из трех подклассов.

1. Простой или обогащенный маннозой комплекс, в котором оли-госахарид содержит маннозу и N-ацетилглюкозамин в гептасахарид-ном коре (рис. 3.16).

2. Нормальный комплекс, в котором обогащенный маннозой кор имеет дополнительные боковые ветви, содержащие другие сахарид-ные остатки, например сиаловую кислоту.

3. Большой комплекс, в котором содержится длинный полимер с повторами Gal/3 l-4GlcNAc. Такой комплекс связан с белком полосы 3 — анионным переносчиком мембраны эритроцитов (см. разд. 8.3.3).

Большинство олигосахаридов мембранных гликопротеинов принадлежат к подклассу 1 или\2. Олигосахариды, принадлежащие дан-

Рис. 3.16. Гликозидные связи, обычно обнаруживаемые в мембранных гликопротеи-нах. А. /V-Гликозидная связь. Б. О-Гликозидная связь. В. Олигосахаридный кор, обогащенный маннозой.

ному подклассу, обладают выраженным структурным сходством, поэтому вряд ли сахарные остатки каждого гликопротеина выполняют какие-то специфические функции.

На рис. 3.17 приведена структура типичного гликопротеина — гликофорина А из мембраны эритроцитов. Этот полипептид имеет единственный гидрофобный трансмембранный участок и гликозили-рован путем присоединения единственного N-гликозидного олигоса-харида и 15 серин/треонин-связанных олигосахаридов. Все они расположены на N-концевой половине полипептида, которая является виецитоплазматической.

3.10. Резюме

Мембранные белки связываются с мембранами разными способами. Ассоциация некоторых периферических мембранных белков с поверхностью мембраны осуществляется при помощи электростатических и гидрофобных нековалентных взаимодействий. В других случа-

Рис. 3.17. А. Первичная структура гликофорина А из эритроцитов человека. Черные кружки — гидрофобный трансмембранный участок полипептида. Указаны места кова-лентного присоединения углеводов (СНО), а также представлены различия в последовательностях М - (вверху) и N - (внизу) вариантов гликофорина А. (Данные предоставлены д-ром Н. Furthmays и взяты из работ [1460] и [475].) Б. Предполагаемая структура N-связанного (вверху) и О-связанного (внизу) олигосахаридов, присоединенных к гликофорину А. (Из работ [475, 1460 и 469].)

ях белки прикрепляются к мембране с помощью ковалентно связанных с ними липидов. Многие мембранные белки содержат неполярные домены, внедряющиеся в гидрофобную сердцевину би-слоя. Исследования фотосинтетических реакционных центров бактерий и бактериородопсина свидетельствуют о том, что основным неполярным элементом является трансмембранная а-спираль. Исходя из данных об аминокислотной последовательности, были построены модели интегральных мембранных белков, содержащие от 1 до 12трансмембранных а-спиралей. Для идентификации сегментов, потенциально способных образовывать подобные спирали, используются специальные алгоритмы, однако применять такие подходы следует с осторожностью. Как показали исследования поринов из наружной мембраны грамотрицательных бактерий, эти белки, по-видимому, обладают трансмембранными /3-структурами, имеющими форму /3-цилиндра. Для более надежной интерпретации данных, получаемых с помощью алгоритмов для идентификации трансмембранных элементов, необходимы дополнительные экспериментальные данные по способам укладки мембранных белков.

С разработкой новых методов очистки мембранных белков, основанных на применении различных детергентов, а также с использованием методов секвенирования ДНК удастся получить новую информацию о структуре мембранных белков. Во многих случаях даже в отсутствие очищенного мембранного белка из данных по секвениро-ванию ДНК можно определить его аминокислотную последовательность и с использованием алгоритмов для выявления трансмембранных участков построить модель укладки белка в бислое. По всей вероятности, таких моделей будет появляться все больше, и необходимо разрабатывать новые методы для их экспериментального подтверждения.

Данные по вторичной и четвертичной структуре очищенных мембранных белков можно получить с помощью биохимических и спектроскопических методов. Однако для построения моделей с высоким разрешением, необходимых для установления связи между структурой и функцией многих мембранных белков, следует применять рентгеноструктурный анализ. Показательным в этом отношении является успех, достигнутый при изучении реакционных центров бактерий.