Тема: Физиология растительной клетки (стр. 2 )

В бензиновый слой переходят каротин и ксантофилл, а в спиртовой – натриевая соль хлорофиллиновой кислоты.

Задание: зарисовать окраску слоев, указывая распределение пигментов.

*Получение феофитина и обратное замещение водорода атомом металла.

Феофитин присутствует в растения в незначительных количествах, но выполняет важную функцию в цепи переноса электронов. Его легко получить и изучить его химические свойства.

Атом магния сравнительно слабо удерживается в порфириновом ядре хлорофилла и при осторожном воздействии сильных кислот легко замещается двумя протонами с образованием нестойкого соединения бурого цвета – феофитина:

COOC20H39

MgN4OH30C32 + 2HCl →

COOCH3

COOC20H39

→ H2N4OH30C32 + MgCl2

COOCH3

Если на феофитин действовать солями меди, цинка или ртути, то вместо двух протонов в ядро входит соответствующий металл и продукты реакции окрашиваются в зеленый цвет. Однако полученная окраска несколько отличается от окраски хлорофилла:

COOC20H39

H2N4OH30C32 + Cu(CH3COO)2 →

COOCH3

COOC20H39

CuN4OH30C32 + 2CH3COOH

COOCH3

В этом случае ионы металлов вытесняют водород в молекуле феофитина и занимают центральное положение в его молекуле, образуя очень стойкое соединение – металлозамещенный хлорофилл. Следовательно, цвет хлорофиллов обусловлен металлорганической связью в их молекулах. Обратное введение магния в феофитин происходит с большим трудом.

В три пробирки берут по 2 мл спиртовой вытяжки пигментов. Одну пробирку оставляют для контроля. В двух других приготовляют феофитин. Для этого в пробирки добавляют по 2-3 капли 10%-ной соляной кислоты. При взбалтывании зеленая окраска хлорофилла переходит в бурую, характерную для феофитина. Одну пробирку с феофитином оставляют для контроля, а во вторую вносят несколько кристаллов ацетата меди (цинка) и нагревают раствор на водяной бане до кипения. По мере нагревания бурый цвет раствора переходит в зеленый в результате образования хлорофиллоподобного производного меди.

Задание: записать уравнения реакций получения металлозамещенного хлорофилла, зарисовать окраску феофитина и медьпроизводного хлорофилла. Закрыть пробирки пробками, подписать и оставить в штативе на свету. Через неделю сделать выводы о стойкости хлорофилла и металлозамещенного хлорофилла, отмечая изменения цвета раствора.

Работа 2. Разделение пигментов по Краусу

Один из первых методов разделения пигментов был предложен немецким ученым Краусом в 1860 г. Он основан на различной растворимости пигментов в спирте и бензине. Указанные растворители в одном сосуде не смешиваются, а образуют две фазы – верхнюю бензиновую и нижнюю спиртовую, благодаря чему разделяются компоненты смеси пигментов.

Цель работы: ознакомиться с методом, получить растворы каротина и ксантофилла.

Материалы и оборудование: штатив с пробирками, этанол, NaOH или KOH кристаллические, бензин, колба Бунзена со стеклянным фильтром.

Растения: листья любых растений или спиртовой экстр акт из листьев.

Ход работы

В пробирку наливают 2-3 мл спиртового экстракта пигментов, добавляют 3-4 мл бензина и одну каплю воды (для лучшего отделения спирта от бензина). Содержимое пробирки сильно встряхивают, предварительно закрыв ее пробкой или большим пальцем, и оставляют отстаиваться. По мере расслоения эмульсии бензиновый слой будет окрашиваться в зеленый цвет из-за лучшей растворимости в нем хлорофиллов. В бензин переходит и каротин, но его окраска маскируется окраской хлорофилла. Ксантофилл остается в спиртовом слое и придает ему золотисто-желтую окраску.

Если пигменты разделяются недостаточно четко, добавляют 3-4 капли воды и снова встряхивают. При избытке воды возможно помутнение нижнего слоя. В этом случае следует прилить немного этилового спирта и взболтать содержимое пробирки.

Для отделения каротина и хлорофилла верхний бензиновый слой пипеткой переносят в чистую пробирку. В этой зеленой вытяжке каротин незаметен. В пробирку добавляют 2 мл этилового спирта и 3-4 капли воды вносят несколько кристалликов щелочи и сильно встряхивают. При взаимодействии щелочи с хлорофиллом происходит его омыление, образуется щелочная соль хлорофиллина, которая легко переходит из бензина в спирт. В результате в пробирке образуются два слоя: верхний, бензиновый, слой – желтого цвета с содержанием каротина и нижний, спиртовой, – зеленого цвета, содержащий щелочную соль хлорофиллина.

Задание: зарисовать пробирки распределения пигментов; сделать выводы о растворимости пигментов в различных растворителях и способах выделения индивидуальных пигментов.

Работа 3. Демонстрация фотосенсибилизирующей активности хлорофилла в модельном опыте

В 1948 г. академик простым опытом доказал, что хлорофилл в фотосинтезе является участником и инициатором окислительно-восстановительных реакций. Показать эту способность хлорофилла можно в модельном опыте с помощью двух соединений – аскорбиновой кислоты (АК) и метилового красного (МК), обладающих окислительно-восстановительными свойствами. АК способна к необратимой окислительно-восстановительной реакции с образованием дегидроаскорбиновой кислоты (ДГАК), что сопровождается переносом электрона к акцептору:

C6H8O6 – 2 ē → C6H6O6 + 2 ē + 2H+

В этом заключается важнейшая функция АК в клетках живых организмов, где она выступает в качестве источника энергии, отдавая электроны и протоны в дыхательную элекронно-транспортную сеть. Окислительно-восстановительный потенциал (Е0) АК равен 0,1 эВ (при рН=5,75). АК является восстановителем, а в данной реакции – донором электронов.

МК тоже обладает окислительно-восстановительными свойствами, и его Е0 составляет 0,8 эВ. Являясь окислителем, МК в силу большой разницы потенциалов (∆Е0=0,7 эВ) не может окислить АК спонтанно. Однако осуществить восстановление МК можно с помощью фотосенсибилизатора, т. е. вещества, использующего энергию света и стимулирующего химическую реакцию, но не участвующего в ней. Таким образом, как бы моделируется принцип цепи окислительно-восстановительных реакций, происходящих при фотосинтезе после поглощения света молекулами хлорофилла. Транспорт электронов в окислительно-восстановительной реакции с участием фотосенсибилизатора (возбужденного хлорофилла) можно представить в виде схемы:

hv

-2 ē ↓ 2 ē

АК (донор) → хлорофилл* → МК (акцептор)

↓ -2H+ (фотосенсибилизатор) ↓ +2H+ hv

↓

ДГАК МК, восстановленный

в лейкосоединение

В тилакоидной же мембране хлоропласта, благодаря высокоэнергетическому электрону (ē), хлорофилл обладает свойствами сильного восстановителя и может восстанавливать редокс-системы с большим отрицательным потенциалом. Отдаваемый при этом электрон остается высокоэнергетическим и может свою энергию потратить на последующие окислительно-восстановительные реакции, направленные на переброс протонов с наружной стороны мембраны тилакоида на внутреннюю для последующего синтеза АТФ.

Цель работы: с помощью модельного опыта продемонстрировать фотосенсибилизирующую активность хлорофилла.

Материалы и оборудование: лампа 100W, штатив, пробирки, ступка, пестик, черная бумага, этанол, кристаллическая аскорбиновая кислота (АК), насыщенный спиртовой раствор метилового красного (МК).

Растения: зеленые листья любых растений.

Ход работы

Листья (0,5 г) размельчают в ступке с добавлением 5-6 мл этанола. Осадок пропускают через воронку с бумажным фильтром, экстракт хлорофилла (ХЛ) разливают поровну в три пробирки. Опыт закладывают в четырех вариантах (табл. 1).

Таблица 1

Обнаружение фотохимической активности хлорофилла

Вариант опыта	Компоненты среды и освещенность	Первоначаль-ный цвет	Изменение цвета	Причины изменения цвета или их отсутствия
1	ХЛ+МК+АК+ свет
2	ХЛ+МК+АК+ темнота
3	ХЛ+МК+ свет
4	МК+АК+ свет

В четвертую пробирку наливают столько же этанола. Затем во все четыре пробирки по каплям добавляют спиртовой раствор метилового красного, пока зеленая окраска не приобретет бурый цвет в первых трех вариантах опыта и красный в 4 варианте. Много добавлять метилового красного не следует.

В пробирки 1, 2 и 4 вариантов добавляют по 30 мг (на кончике скальпеля) кристаллической аскорбиновой кислоты и встряхивают. Во 2 варианте пробирку закрывают черной бумагой. Штатив с пробирками ставят непосредственно перед яркой лампой, поместив между ними сосуд с водой с плоскопараллельными стенками, чтобы предотвратить нагрев растворов.

Через 10-20 мин от начала экспозиции в одной пробирке происходят изменения, и раствор снова приобретает зеленую окраску, так как метиловый красный восстанавливается в лейкосоединение, и только хлорофилл обеспечивает зеленый цвет раствора.

В остальных вариантах опыта красная и красно-бурая окраски не изменяются.

Задание: зарисовать пробирки в конце опыта, после изменения окраски в одном из вариантов. Сделать выводы относительно фотосенсибилизирующей активности хлорофилла, роли АК, МК и света.