МЕТОДЫ СБОРА И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОСТЕЙШИХ
Места сбора. Обычные места обитания простейших – влажные и водные стоячие биотопы (пруды, старицы, канавы и пр.). В текучих водоемах их обычно меньше, но не всегда. Так, в окрестностях г. Барнаула наиболее богатые в видовом отношении пробы, как правило, получаются из р. Барнаулки.
В зависимости от величины, освещенности, прогреваемости, степени загрязнения водоемы по-разному заселены простейшими. Так, в стоячих водоемах с чистой прозрачной водой обычен трубач (р. Stentor). Инфузории группами сидят на различных мелких донных предметах. Подобным же образом скапливаются в больших количествах на водных предметах, сувойки, (p. Vorticella), образуя видимый на глаз налет.
В олигосапробных (слабо загрязненных) водоемах многочисленны колониальные зеленые жгутиконосцы (p. Eudorina, p. Volvox).
В водоемах средней загрязненности органическими веществами (мезосапробных) много эвглен (р. Euglena). Различные их виды живут в разных условиях: на поверхности дна или вблизи его, в сырой земле у самого берега, в поверхностном слое ила, образуя ярко-зеленые пятна (пленки). В таких же или даже более загрязненных (полисапробных) водоемах обитают виды р. Chlamidomonas, массовое размножение которых является основной причиной цветения водоемов в наших условиях. Полисапробные водоемы предпочитают животные жгутиконосцы р. .Bodo.
В стоячих водоемах с гниющими на дне листьями и другими органическими остатками, а также в мелких затененных, медленно текущих, заросших водной растительностью водоемах обитают различные амебы. Вопреки распространенному мнению, р. Amoeba (в частности, A. proteus) встречается редко. Чаще можно обнаружить мелких моноподиальных амеб р.Vahlcampfia. Обычны виды раковинных амеб (р. Centropyxis, р. Arcella, р. Difflugia), а также филозеи р. Euglypha. В больших количествах раковинные корненожки встречаются в торфяном мхе.
Некоторые инфузории, в частности, кинетофрагминофоры р.р. Coleps, Chilodonella Dileptus, Litonotus Loxodes, олигохименофоры р.р. Paramecium, Frontonia Cyclidium, полихименофоры из гипотрихид (р.р.Hypotricha Euplotes, Aspidisca, Stylonychia, Oxytricha) и гетеротрихид (р.р. Spirostomum, Halteria) встречаются в различных типах водоемов, кроме сильно загрязненных.
Лучшие места для взятия проб – пологие берега с гниющими растительными остатками, где происходит обильный рост бактерий, служащих основной пищей для многих простейших. Пробы лучше брать с берега, не более чем в нескольких сантиметрах от поверхности дна, где условия для жизни простейших наиболее оптимальны.
Техника сбора. Обитателей толщи воды можно собирать планктонной сеткой (из газа) или планктонным сачком (микросачком). Можно изготовить такой сачок самостоятельно из подручных материалов (каркас из твердой проволоки, в качестве ткани – старые колготки). Осадок помещают в банку и заливают большим количеством воды из того же водоема.
При сборе донных простейших вместе с водой зачерпывают со да ил. Это можно делать как планктонным сачком, так и с помощью банки (объемом 200-500 мл). При опускании в воду отверстием вниз, емкость быстро поворачивают отверстием кверху около дна водоема. При этом выходящий воздух взмучивает ил, который и зачерпывается сосудом. Кроме того, в сосуд помещают старые листья, водоросли, другие водные растения, кору, веточки и пр.
Для получения простейших из влажных субстратов (почвы, мха) используют выжимки из них. Верхние части (стебли мха) отжимают рукой, прополаскивают в отжатой жидкости и снова отжимают. В отстоявшемся остатке этой жидкости обнаруживаются простейшие.
Для получения возможно более разнообразной фауны простейших берется большое количество проб из разных водоемов. Сосуды для проб должны быть чистыми, ранее не использованными для хранения реактивов. Их обязательно нужно несколько раз прополоскать водой из водоемов, откуда берутся пробы.
При перевозке простейших необходимо защищать их от перегревания.
СОДЕРЖАНИЕ КУЛЬТУР ПРОСТЕЙШИХ В ЛАБОРАТОРИИ
Культуры, взятые из природных водоемов, содержат большое число разных видов и относятся к смешанным или сырым культурам. Лабораторное изучение и определение простейших ведется преимущественно на живом материале, поскольку любая фиксация деформирует или разрушает клетку. Поэтому сырые культуры надо поддерживать, учитывая экологические особенности составляющих их групп.
Для получения фотосинтезирующих форм часть проб нужно поставить в умеренно светлое место, закрыв стеклянными крышками. Однако и эти формы следует защищать от ярких солнечных лучей. Напротив, для развития гетеротрофных видов некоторые пробы следует поместить в затемненное место.
Для простейших опасно перегревание, Оптимальная для культивирования простейших в учебных целях – обычная комнатная температура (18 –220). При +250 обмен и размножение резко ускоряются, культура быстро обогащается количественно, но также быстро и исчезает.
В сосудах с культурами простейших не должно быть их хищников (дафний, циклопов и т.п.).
Некоторые простейшие (например, амебы) обнаруживаются сразу в придонном слое отстоявшейся воды и ила. Другие появляются, спустя несколько дней. Поэтому пробы следует периодически пересматривать на предмет обнаружения новых видов.
С течением времени простейшие начинают плохо размножаться, инцистируются или вовсе исчезают. Это может быть связано с недостатком корма, в частности, бактерий. Для стимуляции развития бактерий в сосуд 2-3 раза в месяц добавляют 5-10 капель сырого молока. Вместо молока можно использовать отвары: рисовый, овсяный, пшеничный, пшенный (50 г одной из круп на 1 л воды, кипятить 15-30 мин). Отвар добавлять к культурам 1-2 раза в месяц по 5-10 см3. Амеб можно подкармливать крахмалом (несколько крупинок на пробу). Хищные инфузории нуждаются в жгутиконосцах и других мелких простейших.
В культуральных банках различные виды простейших распределяются в разных местах, соответствующих естественным местообитаниям. Поэтому банки с культурами нужно держать в покое, не встряхивать. Так, зеленые жгутиконосцы фототропичны и держатся у стороны сосуда, обращенной к свету. Многие инфузории – в придонных слоях. Налет, покрывающий стенки, может содержать раковинных корненожек и солнечников.
Искусственные культуры – это чистые культуры определенных видов простейших, получаемые из свободно живущих особей. Для них используются определенные среды, наиболее оптимальные для данных видов. Ниже приводятся наиболее простые, не требующие специальных ингредиентов рецептуры таких сред.
Инфузории
Наиболее широко в учебном процессе и научных исследованиях используется культура инфузорий, чаще всего инфузории туфельки (Paramecium caudatum). Для получения такой культуры используются следующие среды.
Сенной отвар. 15 -20 г сухого измельченного сена на 1 л чистой воды кипятят 15-30 мин, затем фильтруют, охлаждают до 22-260, и разбавляют свежей водой (одна часть настоя на 20 частей чистой воды). Оставляют на несколько дней. После помутнения, вызванного развитием бактерий, в отвар вносят парамеций. Для поддержания культуры ее время от времени надо пересевать, т.е. полстакана культуры вносить в банку со свежим сенным настоем или иной питательной жидкостью.
Сенной настой. Берут луговое сено, измельчают его и кладут в стеклянный сосуд с дождевой водой. Дня через три к полученному настою добавляют полстакана воды из водоема, богатого разлагающейся органикой.
Молочный раствор. На 150-200 мл водопроводной воды прибавляют по 2-3 капли сырого молока и взбалтывают. В емкость запускают 10-20 парамеций и неплотно закрывают. Через 5-7 дней инфузории сильно размножаются и могут жить в этой среде месяцами, питаясь молочно-кислыми бактериями. Два раза в месяц в культуру следует добавлять по одной капле молока. В молочном растворе успешно размножаются также брюхоресничные инфузории – стилонихии и разноресничные –спиростомумы.
Настой салата. В стеклянный сосуд с кипяченой водой опускают предварительно прокипяченный мешочек из тюля с листьями салата. Сосуд закрывают стеклянной пластинкой. В таком настое развивается особенно благоприятная для туфелек бактериальная флора.
Морковный настой. Кусочек моркови помещают в банку с водой (1 г на 1 л воды) и ставят в темное теплое место (22-260). Через несколько дней (от двух) сформируются благоприятные для заселения инфузорий условия.
Настой на сухих дрожжах. В стеклянный сосуд с водой добавляют несколько крупинок сухих дрожжей и запускают парамеций.
Настой на бумажном пакетике чая. Готовится аналогично сенному настою, при этом следует использовать чай без ароматизаторов.
Для отделения парамеций от других инфузорий можно воспользоваться следующим приемом. Каплю с инфузориями из сырой культуры помещают на предметное стекло. Рядом на более освещенное место наносят каплю свежей воды и соединяют обе капли водной перемычкой с помощью остро заточенной спички. Туфельки быстрее других переберутся в чистую каплю. Затем их с помощью пипетки переносят в сосуд для разведения.
Активные хищники дилептусы (Dileptus) и дидиниумы (Didinium) хорошо разводятся на сенных или навозных (см. ниже) культурах при наличии достаточного количества пищи (парамеций, которых разводят в отдельной культуре)/
Дилептусы очень хорошо живут в чашках Петри на зернах риса (способ получения отвара см. ниже). Получается многочленная культура: на рисе разводятся бактерии, которыми питаются туфельки, а они, в свою очередь, служат пищей хищникам.
Амебы
Для культивирования амеб удобны невысокие сосуды. Основные питательные среды для амеб:
Почвенно-древесный настой. Готовится заливкой ¼ по объему огородной почвы и ¾ сырой воды. Выдерживается 7-10 дней. В течение такого же срока настаивается сырая вода на молодых ветках лиственных деревьев (лучше березы). После сливания равных частей этих настоев среда готова для заражения через 5-7 дней.
Отвар рисовых зерен. Для этого круто отваривают рис, несколько десятков отдельных рисовых зерен помещаются в чашки Петри и заливаются кипяченой водой. Через несколько дней, когда вокруг зерен разовьется бактериальная флора, производится заражение амебами.
Агар-агар. Агар-агара – 0,5-1,0 г, водопроводной воды – 90 см3 (90 мл), щелочного питательного бульона – 10 г. После кипячения разливают в чашки Петри и стерилизуют. Эта среда хорошо подходит и для культивирования инфузорий.
Жгутиконосцы
Эвглены и другие жгутиконосцы могут быть получены вместе с амебами на сенных настоях. Зоофлагеллят удается культивировать в «навозных» культурах.
Навозный настой. Небольшое количество слегка перепревшего конского навоза заливается на 2/3 водой. Через несколько дней наблюдается массовое развитие различных простейших, в том числе животных жгутиконосцев р.Bodo. Наиболее подходящие сосуды для культивирования зоофлагеллят – чашки Петри и плоскодонные колбы.
