Ферменты (стр. 4 )

Важно помнить также, что для проявления активности многих ферментов необходимо присутствие ионов соответствующих металлов, которые выступают в роли кофакторов.

Влияние рН В ряде ситуаций значение рН в клетке изменяется весьма существенно. Например, в мышечных клетках при физической работе происходит расщепление АТФ до АДФ (или АМФ), высвобождается фосфорная кислота и накапливается лактат. В результате накопления лактата рН понижается до 5,0, и в этих условиях фермент креатинкиназа начинает катализировать синтез АТФ, необходимого клетке в этот момент, из креатинфосфата и АДФ:

В состоянии покоя рН внутри клеток повышается до 9,0 и реакция протекает в противоположном направлении, приводя к накоплению креатинфосфата.

Изменение концентрации ингибиторов и активаторов

Иногда в клетке резко изменяются концентрации тех или иных метаболитов, которые могут выступать в роли аллостерических эффекторов. В описанном выше примере работающей мышцы в клетке накапливаются молекулы АМФ, способные аллостерически активировать фосфорилазу b, катализирующую распад гликогена. В результате в клетке ускоряются гликогенолиз и другие процессы, приводящие к синтезу новых молекул АТФ, необходимых для работы мышцы.

В качестве активаторов фермента, как было сказано выше, часто выступают молекулы субстрата.

Для многих процессов, включающих последовательные ферментативные реакции, характерным является так называемое ингибирование по типу обратной связи или ретроингибирование, заключающееся в торможении одного из первых ферментов конечным продуктом цепи превращений. Ретроингибирование позволяет затормозить процесс в самом начале, если синтезируемый продукт имеется в достаточном количестве:

Часто такое ингибирование происходит по аллостерическому механизму. Пример ретроингибирования – синтез гема. Первую, ключевую реакцию синтеза гема катализирует фермент аминолевулинатсинтаза, аллостерическим ингибитором которого является сам гем. Скорость синтеза глобина (белковой части гемоглобина) также зависит от наличия гема: он ускоряет биосинтез белковых цепей, необходимых для проявления его биологической активности.

Изменение четвертичной структуры фермента Для ряда ферментов, наделенных четвертичной структурой, и мультиферментных комплексов наблюдается зависимость ферментативной активности от числа субъединиц. Например, фермент люцифераза, вызывающий свечение светлячков и перспективный для использования в аналитических целях, практически неактивен в виде мономера, умеренно активен в димерной форме и наиболее активен в тетрамерном состоянии.

Химическая модификация молекул фермента

В клетке наблюдаются многочисленные случаи модификации ферментов с целью регуляции их активности. Приведем два наиболее распространенных примера.

Многие ферменты синтезируются в виде проферментов и, в случае необходимости, быстро активируются протеиназами путем частичного прицельного протеолиза (выщепления небольших пептидов из молекулы фермента) и последующего изменения третичной структуры. Для изменения активности ферментов часто используется ковалентная модификация их молекул путем фосфорилирования – образования сложных эфиров фосфорной кислоты с гидрокси-группами таких аминокислот, как серин, треонин, тирозин.

Необходимо отметить, что некоторые ферменты более активны в фосфорилированной форме (например, фосфорилаза а), а некоторые - в дефосфорилированной (например, гликогенсинтаза). Дефосфорилирование ферментов катализируют ферменты протеинфосфатазы.

Влияние компартментализации на активность ферментов. Появление активаторов, ингибиторов фермента и его субстрата внутри клетки регулируется системами транспорта веществ. Например, скорость проникновения глюкозы в клетки значительно повышается при увеличении в крови концентрации инсулина. В клетке некоторые ферменты находятся в определенных органеллах (компартментах) и пространственно отделены от тех субстратов, на которые они действуют. Например, гидролитические ферменты сосредоточены внутри лизосом, поэтому они не могут подвергать гидролитическому расщеплению цитоплазматические белки. В ядре находятся ферменты, связанные с синтезом молекул ДНК и РНК, а в цитоплазме ферменты гликолиза. Такая локализация ферментов способствует упорядоченности обменных процессов.

Некоторые ферменты способны эффективно работать только внутри определенных органелл. Например, если глюкоцереброзидаза не попадает внутрь лизосом, она не осуществляет расщепление обладающих токсическим действием глюкоцереброзидов, в результате чего они накапливаются в тканях и развивается одна из, так называемых, «болезней накопления» - болезнь Гоше.

9. Использование ферментов в медицине

В настоящее время медицинская энзимология развивается двумя путями. Один путь – энзимотерапия, другой – энзимодиагностика.

Энзимотерапия – использование ферментов в качестве лечебных средств в терапии, хирургии, гинекологии, урологии, стоматологии и многих других областях медицины. Широко распространена заместительная терапия заболеваний желудочно-кишечного тракта, основанная на использовании пищеварительных ферментов амилазы, липазы, протеиназ: пепсина, трипсина, химотрипсина, коллагеназы, эластазы.

Известно, что протеиназы легко расщепляют белки мертвых клеток, поэтому их применяют для очистки ран, лечения воспалительных заболеваний, сильных ожогов и обморожений. Ферментативный препарат рибонуклеазу используют при лечении вирусных заболеваний, гиалуронидазу применяют для рассасывания рубцов после операций. Ферменты используют в онкологии, в частности, аспарагиназу, катализирующую расщепление аспарагина, для лечения лейкозов.

Энзимодиагностика заключается в уточнении диагноза заболевания на основе определения активности фермента в биологических жидкостях организма. Понижение или повышение активности ферментов в крови, а также появление в крови ферментов, отсутствующих в норме, служит диагностическим критерием при патологии.

Для диагностики органических и функциональных поражений органов и тканей применяются ферментные тесты, характеризующиеся относительно высокой чувствительностью и специфичностью.

Определение активности ферментов в биологических жидкостях в настоящее время является обязательным компонентом диагностики:

- инфаркта миокарда (креатинкиназа, лактатдегидрогеназа и их изоферментный состав);

- заболеваний поджелудочной железы (амилаза сыворотки крови и мочи);

- патологии печени (аминотранасферазы – аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), щелочная фосфатаза, γ – глутамилтрансфераза);

- при карциноме простаты (кислая фосфатаза).

При инфаркте миокарда наблюдают достоверные изменения в крови активности ферментов креатинкиназы (КК) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и их изоферментного состава, аминотрансфераз – ACT и АЛТ, которые зависят от времени, прошедшего от начала развития инфаркта и от зоны тканевого повреждения (рис. 13). Обнаружение повышенной активности КК в плазме крови - основной энзимодиагностический критерий инфаркта миокарда. Если у пациента с загрудинными болями не обнаружено изменения в активности КК, диагноз инфаркта миокарда маловероятен.

Рис.13 Изменение активности ферментов в плазме крови при инфаркте миокарда. ( 2009). Обозначения ферментов даны в тексте.

Креатинкиназа имеет 3 изофермента – ВВ, МВ, ММ. Изофермент ВВ находится преимущественно в головном мозге, ММ – в скелетных мыщцах и МВ – в сердечной мыщце. При инфаркте миокарда происходит повышение количества МВ – изоформы.

Одним из распространенных и часто используемых методов в энзимодиагностике является иммуноферментный анализ (ИФА), в котором ферменты выступают в качестве неотъемлемого компонента тест-системы. Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии антитела и антигена с последующем присоединением к полученному комплексу конъюгата (антивидового иммуноглобулина, меченного ферментом). Фермент вызывает разложение хромогенного субстрата с образованием окрашенного продукта, который выявляется либо визуально, либо фотометрически.

Получение иммобилизованных (закрепленных) ферментов, значительно расширило сферу применения биокатализаторов. Сущность иммобилизации ферментов — прикрепление их в активной форме к нерастворимой основе или заключение в полупроницаемую мембранную систему за счет чего резко повышается стабильность фермента. Прикрепление фермента к носителю осуществляется адсорбционно, химической связью или путем механического включения фермента в органический или неорганический гель. В медицине иммобилизованные ферменты открыли путь к созданию лекарственных препаратов пролонгированного действия со сниженной токсичностью и аллергенностью. Иммобилизационные подходы способствуют решению проблемы направленного транспорта лекарств в организме. Ряд иммобилизованных ферментов с успехом применяются в медицине:

- использование тампонов, бинтов с иммобилизованными на них протеиназами для заживления ран и ожогов;

- создание протезов кровеносных сосудов и сердечных клапанов из тромборезистентного материала на основе полимеров с иммобилизованными на них тромболитическими ферментами;

- использование иммобилизованных ферментов в экстракорпоральных реакторах (уреазы, фенилаланиламмиклиазы – в лечении соответственно почечной недостаточности, фенилкетонурии).

Иммобилизованная пенициллинамидаза служит для выработки 6-аминопенициллановой кислоты, используемой в синтезе полусинтетическиъх пенициллинов из природного пенициллина, а иммобилизованная β-галактозидаза – для получения диетического безлактозного молока.

Кроме того, ферменты используют, как избирательные реагенты для количественного определения нормальных или патологических компонентов сыворотки крови, мочи, желудочного сока и др. Так, глюкозооксидазу применяют для количественного определения глюкозы в моче, а фермент уреазу для определения мочевины в крови и моче. При определении содержания холестерина в сыворотке крови используют несколько ферментов: холестеринэстераза расщепляет сложноэфирную связь в эфирах холестерина (форма депонирования холестерина), полученный свободный холестерин окисляется холестериноксидазой до кето-формы холестерина и пероксида водорода, последний под действием пероксидазы окисляет фенол до окрашенного соединения (оптическую плотность которого определяют фотометрически).