Приложение
к Методологии анализа и качественной
оценки молока и молочных продуктов
Определение содержания обезжиренного сухого молока в комбинированных кормах путем ферментативного свертывания параказеина
1. Цель метода состоит в количественном определении содержания обезжиренного сухого молока в комбинированных кормах путем ферментативного свертывания параказеина.
2. Данный метод применяется для комбинированных кормов, содержание обезжиренного сухого молока в которых составляет не менее 10%. Присутствие большего количества пахты и/или определенных белков немолочного происхождения может привести к возникновению помех.
3. Принцип метода заключается в:
1) растворении казеина, содержащегося в комбинированном корме, при помощи экстракции при использовании раствора цитрата натрия;
2) получение необходимой концентрации ионов кальция для осаждения казеина путем добавления сычужного фермента;
3) содержание азота в выпавшем в осадок параказеине определяется по методу Кьельдаля, как он описан в стандарте SM EN ISO 8968-1:2014; содержание обезжиренного сухого молока рассчитывается на основании не менее 27,5% содержания казеина (пункт 8).
4. Все реактивы, используемые в целях проведения анализа, должны обладать необходимой степенью чистоты. Необходимо использовать дистиллированную воду или воду с аналогичной степенью чистоты. За исключением сычужного фермента, все используемые реактивы и растворы не должны содержать вещества, содержащие азот.
1) Тринатрий цитрат (раствор 1 % м/в)
2) Хлорид кальция (раствор с концентрацией, примерно, 5 М)
75 г CaCl2 · 2 H2O растворяются в 100 мл дистиллированной воды путем встряхивания (внимание: экзотермическая реакция). Раствор оставляется на ночь, после чего фильтруется. Раствор следует хранить в холодильнике.
3) Гидроксид натрия 0,1 N
4) Хлорводородная кислота 0,1 N
5) Жидкий телячий сычужный фермент (концентрация, примерно, 100 IMCU/мл). Раствор необходимо хранить в холодильнике при температуре от 4-6°C.
6) Реактивы для количественного определения азота по методу Кьельдаля, как он описан в стандарте SM EN ISO 8968-1:2014.
5. Стандартное лабораторное оборудование, содержащее:
1) ступка или машина для гомогенизации;
2) аналитические весы с точностью в 1 мг с делением 0,1 мг;
3) настольная центрифуга (500 г или 2 000-3 000 оборотов/мин) с трубками емкостью 50 мл и 2 000 г;
4) магнитная мешалка (10-15 мм) со штоками;
5) химические стаканы емкостью 150-200 мл;
6) колбы емкостью 250 и 500 мл;
7) стеклянная воронка диаметром 60-80 мм;
8) беззольный фильтр для быстрого фильтрования диаметром 150 мм;
9) пипетки разного размера;
10) водяная баня с термостатом, регулируемая до температуры 37 °C ± 1 °C;
11) аппарат для измерения рН с точностью до 0,1 единиц;
12) термометры с точностью до 1°C.
6. Процедура определения содержания обезжиренного сухого молока в комбинированных кормах путем ферментативного свертывания параказеина осуществляется следующим образом:
1) Приготовление пробы
Размельчаются в ступке или обрабатываются в машине для гомогенизации от 10 до 20 г пробы, до получения однородной смеси.
2) Сухое молоко растворяется, а нерастворившийся остаток отделяется:
a) 1,000 ± 0,002 г гомогенизированного комбинированного корма взвешивается непосредственно в центрифугальной трубке емкостью 50 мл. 30 мл раствора тринатрий цитрата нагреваются до температуры 45 °C ± 2 °C и добавляются в трубку. Раствор перемешивается в течение не менее 5 минут при помощи магнитной мешалки, а затем хорошо встряхивается рукой;
b) пробы центрифугируются в течение 10 минут при 500 г (2 000-3 000 оборотов/мин), после чего жидкая фракция сливается в химический стакан емкостью от 150 до 200 мл. При сливании необходимо следить за тем, чтобы материал не утерялся;
c) тем же методом проводятся еще две экстракции из остатка. Оба новых экстракта добавляются к первому экстракту;
d) в случае осаждения жира, пробу необходимо охладить до затвердения жировой фазы, после чего затвердевший жир удаляется при помощи шпателя.
3) Свертывание казеина под воздействием сычужных ферментов
a) при постоянном помешивании 2 мл хлорида кальция добавляются покапельно к общему водному экстракту (примерно 100 мл). Уровень рН регулируется при помощи раствора NaOH или HCl до 6,4-6,5. Раствор оставляется на 15-20 минут на водяной бане с термостатом, настроенной на 37 °C ± 1 °C, до тех пор, пока не наступит солевое равновесие. Если раствор приобрел молочный вид, равновесие наступило;
b) жидкость переносится в одну (или две) центрифугальные трубки и центрифугируется в течение 10 минут при 2000 г, для того чтобы удалить осадки. Жидкая фракция сливается в одну (или две) центрифугальные трубки, без вымывания осадка;
c) жидкая фракция нагревается вновь до температуры 37 °C ± 1 °C. При постоянном помешивании в экстракции покапельно добавляется 0,5 мл сычужного фермента. Свертывание происходит в течение двух минут;
d) проба вновь помещается в водяную баню и оставляется там на 15 минут при температуре 37 °C ± 1 °C. Проба извлекается из бани, и коагулят измельчается путем помешивания. Проба центрифугируется в течение 10 минут при 2000 г. Жидкая фракция фильтруется через подходящую фильтровальную бумагу, и фильтровальная бумага сохраняется. Осадок промывается путем перемешивания в центрифугальной трубке 50 мл воды при температуре 35 °C.
Еще раз проба центрифугируется в течение 10 минут при 2000 г. Жидкая фракция фильтруется через сохраненную фильтровальную бумагу.
4) Определение содержания азота в казеине
После промывания осадок при помощи дистиллированной воды пропускается через фильтровальную бумагу, сохраненную согласно литере d) подпункта 3) пункта 6). Фильтровальная бумага помещается в колбу Кьельдаля. Содержание азота определяется по методу Кьельдаля, как он описан в стандарте SM EN ISO 8968-1:2014.
7. Регулярно проводится холостой опыт, в ходе которого проба минерализируется по методу Кьельдаля, как он описан в стандарте SM EN ISO 8968-1:2014. Беззольная фильтровальная бумага увлажняется смесью из 90 мл цитрата натрия, 2 мл раствора хлорида кальция и 0,5 мл жидкого сычужного фермента, после чего три раза промывается по 15 мл дистиллированной воды.
Объем кислоты, необходимый для проведения холостого опыта, необходимо вычесть из объема, использованного для титрации пробы.
8. Содержание обезжиренного сухого молока в комбинированном корме рассчитывается по следующей формуле:
где:
N – процентное содержание азота в параказеине;
27,5 – коэффициент для пересчета установленного казеина на сухое обезжиренное молоко в процентах;
2,81 и 0,908 – коррекционные коэффициенты, полученные из регрессионного анализа.
9. Точность метода получается из величины для повторяемости и воспроизводимости:
1) Повторяемость
Разница между двумя отдельными результатами, полученными при использовании одной и той же пробы, в одной лаборатории одним и тем же аналитиком, не должна превышать 2,3 г обезжиренного сухого молока на 100 г проверенного комбикорма.
2) Воспроизводимость
По крайней мере, в 95% изученных случаев разница между двумя результатами, полученными двумя лабораториями при использовании одной и той же пробы, не должна превышать 6,5 г обезжиренного сухого молока на 100 г проверенного комбикорма.
10. Во время процедуры могут возникнуть следующие ситуации:
1) добавление большего количества определенных посторонних белков, в частности соевых белков, если они нагреваются вместе с обезжиренным сухим молоком, может дать в результате завышенные показатели, поскольку эти вещества оседают одновременно с молочным параказеином;
2) добавление пахты может дать в результате заниженные показатели, поскольку при определении учитывается только обезжиренная часть. Добавление определенных видов пахты, полученных из кислых сливок, может дать в результате существенно заниженные показатели, поскольку они растворяются не полностью в растворе цитрата;
3) добавление 0,5% или более лецитина может также привести к получению заниженных результатов;
4) использование обезжиренного сухого молока, нагретого до высокой температуры, может привести к получению завышенных результатов, поскольку определенные молочные белки оседают в осадок вместе с параказеином молока.
