Партнерка на США и Канаду по недвижимости, выплаты в крипто
- 30% recurring commission
- Выплаты в USDT
- Вывод каждую неделю
- Комиссия до 5 лет за каждого referral
С помощью цветной реакции можно определить соответствие вируса и вируснейтрализующей сыворотки, если их предварительно смешать и эту смесь после инкубации внести в культуру клеток. Специфическая сыворотка нейтрализует вирус и он не оказывает цитопатическое действие на клетки культуры.
Цветную пробу ставят с различными типами клеточных культур. Чаще берут первичную культуру клеток почки обезьяны или перевиваемые культуры клеток. При постановке цветной реакции необходимо учитывать, что каждая культура клеток, на которой ставят реакцию, имеет определённый уровень метаболизма. Устанавливают дозу клеток для цветной реакции, то есть то оптимальное количество клеток, которое должно быть взято в каждую пробирку.
При работе с культурой почечных клеток обезьяны готовят взвесь клеток густотой 100-200 тыс. в 1 мл. Из неё делают ряд возрастающих разведений в объёме 0,25 мл и определяют минимальное количество клеток, которое при постановке цветной пробы изменяет цвет питательной среды из красного в жёлтый н 5-6-й день выдерживания в термостате; это количество и принимается за дозу клеток. Обычно эта доза – 25 тыс. клеток в объёме 0,25 мл.
Титрование вируса методом цветной пробы
Цветную пробу ставят в пробирках, которые иногда закрывают резиновыми пробками, но чаще разобщение от атмосферного воздуха достигается наслаиванием стерильного вазелинового масла (0,6-0,8 мл) или применение алюминиевой фольги. Однотипную опытную смесь наливают в четыре пробирки.
При оценке результатов реакции учитывают два тона: жёлтый и красный (табл. 3).
При титровании вируса по цветной пробе готовят десятикратные разведения вируссодержащего материала. Эти разведения вируса, взятые в объёме 0,25 мл, смешивают с 1 дозой клеток, содержащейся в таком же объёме, добавляют питательную среду по 0,25 мл и наслаивают вазелиновое масло по 0,6-0,8 мл. В реакции ставят контроли клеточной взвеси: берут 1,1/2 и ¼ дозы клеток. Пробирки помещают на 5-6 дней в термостат при 370С после чего по изменению цвета учитывают реакцию.
Титром вируса по цветной пробе называется то наибольшее разведение вируса, которое вызывает подавление метаболической активности клеток в 50% случаев. В данном примере (табл. 3) титр вируса равен 10-4 (две пробирки красные, две – жёлтые). Количество вируса, содержащееся в объёме 0,25 мл в разведении, равном титру, называется цитопатической дозой (ЦПД50) вируса.
Таблица 3
Схема титрования вируса методом цветной пробы
Ингредиенты опыта (в мл) | № пробирок | ||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | |
Разведения вируссодержащего материала | Контроль клеток | ||||||||
10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 1 доза | ½ доза | ¼ доза | |
Вируссодержащий материал | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | - | - | - |
Взвесь клеток (1 доза) | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 |
Питательная среда | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
Вазелиновое масло | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 |
Возможные результаты | |||||||||
Цвет среды в пробирках (красный или жёлтый) | К-4 | К-4 | К-3 Ж-1 | К-2 титр Ж-2 | К-1 Ж-3 | Ж-4 | Ж-4 | Ж-2 К-2 | К-4 |
Обозначения: | К-4 – красного цвета 4 пробирки; Ж-3 – жёлтого цвета 3 пробирки |
2.2. Применение реакции гемагглютинации (РГА), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и биологических моделей для индикации и идентификации вирусов
Гемагглютинация, вызываемая вирусами, не является иммунологической реакцией, так как здесь нет системы антиген – антитело. С помощью этой реакции легко выявить присутствие гемагглютинирующего вируса, но невозможно его идентифицировать. Вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами, имеют на поверхности гемагглютинины, с помощью которых происходит склеивание эритроцитов. По своей химической природе гемагглютинины являются глико - или липопротеидами.
В процессе взаимодействия вирусов с эритроцитами различают стадии адсорбции, агглютинации и элюции. Адсорбция вирусов на эритроцитах начинается как неспецифическая, а затем переходит в специфическую вследствие сродства гемагглютининов к рецепторам эритроцитов. На одном эритроците адсорбируется множество вирусов, они образуют мостики между эритроцитами, изменяется электростатический заряд эритроцитов и в результате наступает следующая стадия взаимодействия – гемагглютинация, на которой процесс может остановиться. Некоторые вирусы способны к элюции – освобождению с поверхности эритроцитов. Элюция происходит под действием вирусных ферментов (например, нейраминидазы) на рецепторы эритроцитов. Элюированные вирусы при этом не повреждаются, эритроциты же не способны повторно адсорбировать вирус вследствие разрушения рецепторов.
При постановке РГА используют те эритроциты (птиц, животных, человека), с которыми гемагглютинирующие свойства данного вируса проявляются лучше (например, эритроциты кур). Задерживающее действие на РГА могут оказывать ингибиторы, содержащиеся в тканях, где размножался вирус, и других биологических субстратах. Для снятия ингибиторного действия вируссодержащие материалы прогревают, обрабатывают трипсином, ацетоном и др.
2.2.1. Техника постановки РГА
На плексигласовой доске готовят двукратные возрастающие разведения в объёме 0,5 мл исследуемого вируссодержащего материала, начиная с 1:10 и до 1:1280. в луночки с разведениями добавляют равные объёмы 1% взвеси эритроцитов кур. Доску осторожно встряхивают и оставляют на 30-45 мин при комнатной температуре. Учёт результатов проводят по трёхкрестовой системе в зависимости от внешнего вида осадка эритроцитов. При гемагглютинации на «+++» осадок имеет форму зонтика и занимает всё дно лунки. При отсутствии агглютинации эритроциты оседают в центре лунки в виде компактного диска.
Титром вируса называется то наибольшее его разведение, при котором ещё наблюдается выраженная гемагглютинация («+++» или «++»). В нашем примере титр вируса 1:320 (табл. 4). Количественное содержание вируса в разведении, равном титру, называется гемагглютинирующей единицей (содержится в 0,5 мл разведения 1:320). Определение этой величины необходимо для постановки РТГА, в которой в качестве рабочей дозы вируса берут 4 гемагглютинирующие единицы.
Таблица 4
Схема постановки реакции гемагглютинации при диагностике гриппа
Ингре- диенты РГА (в мл) | Номера лунок разведения вируссодержащего материала | ||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | |
1:10 | 1:20 | 1:40 | 1:80 | 1:160 | 1:320 | 1:640 | 1:1280 | К | |
Вирус- содержащий материал | 0,1 | 0,5 | 0,5 вылить | ||||||
Физиоло- гический раствор | 0,9 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
1% взвесь эритроцитов | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
Возможный результат | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | ++ титр | + | - | - |
Если предварительно соединить вирус со специфической иммунной вируснейтрализующей сывороткой и потом добавить эритроциты, то такой инактивированный вирус теряет способность вызывать гемагглютинацию. Эта реакция получила название реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и может быть использована для окончательной идентификации неизвестного гемагглютинирующего вируса – по специфической диагностической сыворотке, а также для выявления титра неизвестных антител в сыворотке больного – по известным вирусным антигенам-диагностикумам.
Затрудняет применение РТГА наличие в сыворотках крови человека и животных неспецифических вирусных ингибиторов, которые могут вызвать неспецифическое торможение гемагглютинации. Выпускают противовирусные диагностические сыворотки, освобожденные от ингибиторов. РТГА ставят обычно на досках с лунками по методике, сходной с РГА.
2.2.2. Техника постановки РТГА
РТГА с целью идентификации вируса гриппа рода А. На плексигласовой доске готовят три ряда двукратных возрастающих разведений (в объёме 0,25 мл) диагностических противогриппозных сывороток А(Н1N1), А(Н2N2) и А(Н3N2) от 1:10 до 1:320 (до титра сывороток). Во все лунки, кроме контрольной, добавляют по 0,25 мл рабочей дозы вируса (разведение 1:40), в котором содержится 4 гемагглютинирующие единицы (табл. 5). После выдерживания реакции в течение 1 часа при комнатной температуре во все лунки добавляют по 0,5 мл 1% взвеси эритроцитов кур. Учёт результатов проводят через 30-40 минут. В примере торможение произошло сывороткой А(Н3N2), следовательно выделен вирус гриппа, принадлежащий к подтипу А(Н3N2).
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 |
Основные порталы (построено редакторами)