Методы культивирования, индикации и идентификации вирусов (стр. 8 )

·  фермент термостабильная ДНК-полимераза – производит достройку комплементарных цепей ДНК из пула свободных нуклеотидов. Фермент выделяют из бактерий Thermus aquaticus или получают генно-инженерным методом.

Сущность ПЦР состоит в том, что определяемая ДНК, находящаяся в тестируемом биологическом материале, подвергается денатурации. Затем праймеры 2-х типов в условиях отжига присоединяются, вследствие их комплементарности, к 3,-концам каждой из антипараллельных цепей, восстанавливая на этом участке двухспиральную структуру ДНК. Праймеры служат «затравками» для последующей достройки цепей ДНК, осуществляемой термостабильной ДНК-полимеразой, которая использует для этой цели свободные нуклеотиды.

В результате одного цикла ПЦР количество молекул определяемой ДНК удваивается, то есть происходит амплификация ДНК. Обычно проводят 25-40 повторных циклов амплификации и в итоге за 2-3 часа получают миллионы копий специфического фрагмента ДНК вирусов.

ПЦР проводят в 0,5-1,5 мл микроцентрифужных пробирках в амплификаторах, которые автоматически регулируют смену температуры. Каждому из 3-х этапов цикла амплификации – денатурации ДНК, отжига и достройки – необходима инкубация образцов при различном температурном режиме.

1.  Денатурация – разъединение определяемой двухспиральной ДНК на две изолированные цепи при нагревании до 90-950С в течение 0,5-1,0 мин.

2.  Отжиг – восстановление двухцепочечной структуры определяемой ДНК в области присоединения комплементарного праймера – проводится при температуре 40-600С 0,5 мин.

3.  Удлинение (элонгация) – достройка каждой цепи определяемой ДНК доисходного двухцепочечного состояния с помощью термостабильной ДНК-полимеразы – проводится при температуре 70-750С в течение 2-5 мин.

Наличие ДНК после повторных циклов амплификации определяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, авторадиографией или другими методами.

С помощью ПЦР возможно определение не только нуклеотидной последовательности ДНК, но также РНК и, следовательно, выявление РНК-вирусов (для этого в реакцию вводят обратную транскриптазу). ПЦР особенно ценен для диагностики латентных вирусных инфекций и ВИЧ-инфекции.

Рис. 8. Схема полимеразной цепной реакции

Контрольные вопросы

1.  Индикация вируса по его цитопатическим действиям (ЦПД) и определение титра вируса. Идентификация вируса по нейтрализации ЦПД.

2.  Метод гемадсорбции, его практическое применение, идентификация вируса в реакции задержки гемадсорбции.

3.  Метод бляшек. Идентификация вирусов методом бляшек, титрование антител.

4.  Метод цветной пробы, методика постановки, практическое применение.

5.  Реакция нейтрализации по цветной пробе, её сущность, применение.

6.  Реакция гемагглютинации (РГА), вызываемая вирусами. Практическое применение РГА. Методика постановки.

7.  Сущность реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Методика постановки. Практическое применение.

8.  Реакция нейтрализации вирусов in vivo, способы постановки. Практическое применение.

9.  Молекулярно-генетические методы исследования, их сущность. Принцип метода молекулярной гибридизации.

10.  Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Ингредиенты реакции, их характеристика, значение амплификации. Сущность ПЦР.

11.  Техника постановки ПЦР, практическое применение и оценка, как экспресс-метода диагностики вирусных инфекций.

Тематика докладов

1.  Современные методы диагностики распространённых вирусных инфекций.

2.  Индикация и идентификация вирусов гриппа.

3.  Молекулярно-генетические методы анализа полиморфизма генов.

4.  Молекулярно-генетические методы анализа экспрессии генов.

ЛИТЕРАТУРА

1.  О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. 3-е изд. – М.: Медицина, 1982.

2.  Большой словарь медицинских терминов / Сост. Д. – М.: , 2007.

3.  Вирусология. Методы / Под ред. Б. Мейхи. – М.: Мир, 1988.

4.  А., С., П. Медицинская и санитарная микробиология. – М.: АСАDEMA, 2003.

5.  Б. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. – Л., 1986. Электронный учебник.

6.  ПЦР «в реальном времени» / Под ред. Д. В. Ребрикова; 2-е изд., испр. И доп. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009.

7.  Вирусология. Т. 1-3. – М.: «Мир», 1989.

8.  www. infections. ru/rus/all/mvb journals.shtml

9.  www.

10.  www. medmaster.net

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………….... 3

Раздел 1. Культивирование вирусов ……………………………………………4

1.1. Подготовка материала для вирусологических исследований…………….4

1.1.1. Правила работы в вирусологической лаборатории…………………....4

1.1.2. Материалы, исследуемые при вирусных инфекциях…………….........5

1.1.3. Обработка вируссодержащего материала………………………………5

1.1.4. Микроскопические методы исследования в вирусологии…………….6

1.2. Культуры клеток в вирусологии и методы их получения………………..9

1.2.1. Питательные среды…………………………………………………….11

1.2.2. Типы клеточных культур………………………………………………12

1.3. Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах……...16

1.3.1. Строение куриного эмбриона………………………………………….17

1.3.2. Заражение куриного эмбриона на хорионаллантоисную оболочку....18

1.3.3. Заражение в аллантоисную полость……………………………...........20

1.3.4. Заражение в полость амниона………………………………………….20

1.4. Культивирование вирусов путём заражения лабораторных животных…22

1.4.1. Интраназальное заражение………………….……………………….....23

1.4.2. Интрацеребральное заражение…………………………………............24

Контрольные вопросы………………………………………………………..….25

Тематика докладов……………………………………………………………….25

Литература………………………………………………………………………..25

Раздел 2. Индикация и идентификация вирусов………………………………26

2.1. Методы индикации и идентификации вирусов в клеточных культурах..26

2.1.1. Цитопатическое действие (ЦПД) вируса в культуре клеток…….......27

2.1.2. Реакция гемадсорбции…………………………………………………29

2.1.3. Метод бляшек…………………………………………………………..30

2.1.4. Цветная проба…………………………………………………………..32

2.2. Применение реакции гемагглютинации (РГА), реакции

торможения гемагглютинации (РТГА) и биологических

моделей для индикации и идентификации вирусов……………………...35

2.2.1. Техника постановки РГА………………………………………………36

2.2.2. Техника постановки РТГА……………………………………………..37

2.2.3. Реакция нейтрализации вирусов in vivo………………………………39

2.3. Молекулярно-генетические методы исследования

в диагностике вирусных инфекций……………………………………..41

2.3.1. Молекулярная гибридизация (метод молекулярных зондов)………42

2.3.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) или локальная

амплификация нуклеиновых кислот (ЛАНК)……………………...........43

Контрольные вопросы ………………………………………………………...45

Тематика докладов……………………………………………………………...46

Литература ……………………………………………………………………..46

Основные порталы (построено редакторами)

Домашний очаг Дом • Дача • Садоводство • Дети • Активность ребенка • Игры • Красота • Женщины • (Беременность) • Семья • Хобби Здоровье: • Анатомия • Болезни • Вредные привычки • Диагностика • Народная медицина • Первая помощь • Питание • Фармацевтика История: СССР • История России • Российская Империя Окружающий мир: Животный мир • Домашние животные • Насекомые • Растения • Природа • Катаклизмы • Космос • Климат • Стихийные бедствия Справочная информация Документы • Законы • Извещения • Утверждения документов • Договора • Запросы предложений • Технические задания • Планы развития • Документоведение • Аналитика • Мероприятия • Конкурсы • Итоги • Администрации городов • Приказы • Контракты • Выполнение работ • Протоколы рассмотрения заявок • Аукционы • Проекты • Протоколы • Бюджетные организации Муниципалитеты • Районы • Образования • Программы Отчеты: • по упоминаниям • Документная база • Ценные бумаги Положения: • Финансовые документы Постановления: • Рубрикатор по темам • Финансы • города Российской Федерации • регионы • по точным датам Регламенты Термины: • Научная терминология • Финансовая • Экономическая Время: • Даты • 2015 год • 2016 год Документы в финансовой сфере • в инвестиционной • Финансовые документы - программы

Техника Авиация • Авто • Вычислительная техника • Оборудование • (Электрооборудование) • Радио • Технологии • (Аудио-видео) • (Компьютеры) Общество Безопасность • Гражданские права и свободы • Искусство • (Музыка) • Культура • (Этика) • Мировые имена • Политика • (Геополитика) • (Идеологические конфликты) • Власть • Заговоры и перевороты • Гражданская позиция • Миграция • Религии и верования • (Конфессии) • Христианство • Мифология • Развлечения • Масс Медиа • Спорт (Боевые искусства) • Транспорт • Туризм Войны и конфликты: Армия • Военная техника • Звания и награды Образование и наука Наука: Контрольные работы • Научно-технический прогресс • Педагогика • Рабочие программы • Факультеты • Методические рекомендации • Школа • Профессиональное образование • Мотивация учащихся Предметы: Биология • География • Геология • История • Литература • Литературные жанры • Литературные герои • Математика • Медицина • Музыка • Право • Жилищное право • Земельное право • Уголовное право • Кодексы • Психология (Логика) • Русский язык • Социология • Физика • Филология • Философия • Химия • Юриспруденция

Мир Регионы: Азия • Америка • Африка • Европа • Прибалтика • Европейская политика • Океания • Города мира Россия: • Москва • Кавказ • Регионы России • Программы регионов • Экономика Бизнес и финансы Бизнес: • Банки • Богатство и благосостояние • Коррупция • (Преступность) • Маркетинг • Менеджмент • Инвестиции • Ценные бумаги: • Управление • Открытые акционерные общества • Проекты • Документы • Ценные бумаги - контроль • Ценные бумаги - оценки • Облигации • Долги • Валюта • Недвижимость • (Аренда) • Профессии • Работа • Торговля • Услуги • Финансы • Страхование • Бюджет • Финансовые услуги • Кредиты • Компании • Государственные предприятия • Экономика • Макроэкономика • Микроэкономика • Налоги • Аудит Промышленность: • Металлургия • Нефть • Сельское хозяйство • Энергетика Строительство • Архитектура • Интерьер • Полы и перекрытия • Процесс строительства • Строительные материалы • Теплоизоляция • Экстерьер • Организация и управление производством