Исследование молекулярной и наноструктурной динамики биологических тканей под Влиянием высокочастотной электрохирургической сварки

Труды международной научно-технической конференции «Нанотехнологии функциональных материалов НФМ’2012». 2012, Санкт-Петербург, Россия, с. 704-709.

Исследование молекулярной и наноструктурной динамики биологических тканей под Влиянием высокочастотной электрохирургической сварки

1,2, 1, 1, 2, 3, 2, 2, 4, 5, 6, 5, 5, 5,6, 5,6, 5

1 ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук

2 НИЦ «Курчатовский институт», Россия, a-zabelin@mail. ru

3 ФГБУН Институт биофизики клетки Российской академии наук

4 Индийский институт технологий, Отделение биотехнологий, Кхарагпур, Индия

5 Институт электросварки им. НАН Украины

6 Киевская городская клиническая больница № 1, Украина

the study of the influence of high frequency electrosurgical welding on the structure of different biological tissue was carried out. Using model samples, the test welding conditions have been determined, which do not cause significant differences in X-ray diffraction patterns and fluorescence spectra from tissues affected by high frequency (HF) welding. Based on experimental and clinical data the possibility of HF welding affected tissue to maintain tissue vitality and to restore its physiological properties and functions due to regenerative processes has been demonstrated.

«Сварочные технологии победно шагают на земле, в подводном мире и космосе. Сварка начинает свой путь в медицине. Она успешно применяется для соединения поврежденных тканей человека и восстановления жизнедеятельности его органов» [].

Целью данной работы было исследование влияния высокочастотной электрохирургической сварки на молекулярную и наноструктурную динамику биологических тканей методами структурной биологии с использованием синхротронного излучения (СИ). В последние годы широкое применение в медицине по инициативе академика нашла высокочастотная электрохирургия. Она применяется для рассечения тканей и остановки или предупреждения кровотечений при разрезании тканей и сосудов. В настоящее время применяется около 200 хирургических методик с использованием высокочастотной сварки мягких живых тканей. Успешно выполнено около 70000 операций на людях.

Важнейшими задачами современной хирургии являются разработка и внедрение в клиническую практику новых способов соединения органов и тканей, простых в исполнении для хирурга и щадящих для больного. Существующие традиционные способы восстановления целостности ткани с использованием шовных материалов, сшивающих аппаратов, клеевых композиций и других средств не совершенны. Так, при использовании шовных материалов существует опасность нарушения кровообращения в зоне наложения швов, миграции микроорганизмов по шовным нитям, что может привести к развитию гнойных осложнений, перитонита, гранулем, анастомозитов и перианастомозитов. Существует также реальная угроза развития аллергических реакций организма на инородное тело. Именно поэтому все большее количество исследований в хирургии посвящено поиску новых способов соединения тканей. Распространенный способ соединения тканей с помощью степлеров предусматривает использование аналогов шовных нитей – металлических скобок, которые остаются в тканях и имеют те же недостатки, что и нити. Кроме того, в зоне компрессии наблюдается выраженная ишемия соединяемых тканей, что осложняет процесс регенерации. Склеивание тканей по ряду известных медикам причин также не получило широкого применения. Лазерная сварка не обеспечивает требуемой прочности соединений. Лазерный нагрев с «припоем» на основе белка имеет некоторую перспективу использования в хирургической практике, однако усложненная технология может стать тормозом для широкого применения.

Опыт применения электрохирургии для резки тканей и гемостаза насчитывает около ста лет, основные используемые методы это моно - и биполярная коагуляция. Основное их отличие заключается в том, что при биполярной коагуляции путь тока лежит через ткани, заключенные между двумя браншами биполярного инструмента, при монополярной же коагуляции ток проходит через значительно больший объем тканей больного. Исследовательский коллектив из ИЭС НАНУ разрабатывает и широко использует аппаратуру для биполярной коагуляции. В этом методе электрический ток высокой частоты проходит через стенки «сжатого» сосуда или мелкие сосуды и вызывает их нагрев до температуры 50-55ºС. Биполярную коагуляцию часто используют для герметизации сосудов диаметром до 1,5 мм. Герметизированный биполярной коагуляцией сосуд выдерживает без потери герметичности давление, значительно превосходящее артериальное. В результате проведения комплексных исследований разработаны способ соединения мягких тканей, устройство и инструменты для его осуществления. Идеи, заложенные в разработки, признаны оригинальными и на них выданы патенты. Несомненным достоинством аппаратуры следует считать ее универсальность. Она может быть успешно использована в качестве коагулятора для резки, а также для получения за один прием кольцевых и линейных швов. Наиболее часто используются пинцеты и зажимы. В тех случаях, когда хирургу трудно контролировать давление, ориентируясь только на силу пальцев, удерживающих инструмент, пинцеты оснащаются специальными приспособлениями. Следует подчеркнуть, что стабилизация давления имеет существенное значение. Поскольку у ткани малая упругость, то чем больше сила, с которой электроды сжимают ткань, тем меньше нагреваемый объем, что так или иначе отражается на конечных результатах. При избыточном сжатии неминуем электрический пробой свариваемых слоев, и, наоборот, при недостаточном сжатии нагреваемый объем чрезмерно велик. Использование сварочных технологий позволяет ускорить выполнение оперативного вмешательства в среднем на 20-40 мин и сократить примерно на 200-250 мл потерю крови, а иногда в несколько раз больше; достичь экономического эффекта за счет сокращения показаний к применению дорогих аппаратов и степлеров, экономии шовного материала, клипс и др. Примеры успешного применения высокочастотной электрохирургической сварки мягких тканей человека и животных продемонстрированы в Атласе [1].

Структурные исследования биологических тканей до и после электрохирургического воздействия проводили на разработанной нами станции «Дифракционное кино» ДИКСИ [2-4] методами рентгеновской дифракции под малыми и большими углами (SAXS/WAXS) с использованием синхротронного излучения накопителя «Сибирь-2» (НИЦ «Курчатовский институт», Москва). Слабая рассеивающая способность биологических тканей диктует крайне жесткие требования к интенсивности рентгеновского источника и к концентрации исследуемых образцов. Широкомасштабные рентгендифракционные и спектральные исследования биологических объектов становятся возможными только благодаря использованию уникальных экспериментальных методик, разработанных нами ранее на основе использования СИ. Каждый тип ткани характеризуется специфическим набором фибриллярных белков, структура которых проявляется на рентгенограмме в виде дифракционных линий с соответствующей упорядоченностью на молекулярном и наноструктурном уровнях. Различные органы характеризуется специфическим строением с наличием внутриклеточных и внеклеточных фибриллярных структур межклеточного матрикса, цитоскелета клетки и фибриллярных структур специализированных клеток – мышечных (миозин, актин, тропомиозин), нервных (миелин), кератиноциты, остоациты и др., структурные особенности которых отчетливо выявляются на дифракционных картинах в области малых углов. Информативной оказывается интенсивность, форма, полуширина и число дифракционных линий. Однако по дифракционной картине не всегда однозначно можно определить природу белка и тип его структуры. Разные уровни структурной организации – молекулярный, наноструктурный – могут характеризоваться различной чувствительностью к одному и тому же воздействию на ткань. Химический фиксатор, например формалин, значительно искажает структуру белка на молекулярном уровне, и гораздо слабее эти изменения могут проявиться на наноструктурном уровне. Мы были пионерами в использовании рентгеновской дифракции для исследования внеклеточных фибриллярных структур на примере протеогликановых структур нативных слизей и межклеточного матрикса ткани, от которых была зарегистрирована богатая дифракционная картина в наномасштабном диапазоне [5-7]. Обнаружена корреляция между интегральной интенсивностью рентгенограмм и элементным содержанием; кальций является основным элементом минеральной композиции ткани. Было показано, что наноструктурная упорядоченность может быть обратимо трансформирована катионами металлов и хелатирующими агентами [8-10]. Эти исследования открыли широкую перспективу сравнительных дифференциальных исследований молекулярной и наноструктурной динамики под влиянием разных физико-химических условий (температура, влажность, механическое растяжение, катионная избирательность, ионная сила, рН).

Для проведения высокочастотной электрохирургической сварки в экспериментах использован разработанный в Киевском Институте электросварки им. НАНУ аппарат ПАТОНМЕД ЕКВЗ-300, который предназначен для работы в различных областях хирургии и обеспечивает 4 режима: резка, коагуляция, сварка ручная и сварка автоматическая [1]. Использовался специально разработанный там же инструментарий различных размеров и конструкций. Основные процессы, происходящие при сварке мягких тканей, схематически могут быть описаны следующим образом: соединяемые слои ткани при помощи сварочного инструмента вводятся в соприкосновение своими поверхностными слоями, хирург сжимает с помощью электродов свариваемый участок ткани и включает источник сварочного тока. После выполнения программы управления процессом сварки и отключения энергии захваченная ткань освобождается, затем процесс должен повторяться до полного закрытия раны.

Образцы биологических тканей получали от здоровых экспериментальных животных (свиньи, кролики, крысы) в процессе многочасовой хирургической операции под наркозом методом высокочастотной электрохирургической сварки. Были использованы ткани сердечнососудистой системы (аорта, артериальные и венозные сосуды различного диаметра); лимфатической (селезенка) и нервной системы; образцы эпителиальной и гладкомышечной тканей желудочно-кишечного тракта, поперечнополосатой скелетной мышцы, в также ткани трахеи, бронхов, легких, печени, почек, поджелудочной железы. Поскольку каркас биологических тканей стабилизируется фибриллярными структурами цитоскелета клетки и межклеточного матрикса, в качестве модельных объектов были выбраны различные природные биополимеры с разным типом фибриллярной организации: волокна коллагена, кератин ткани волоса человека и животных. Особый интерес в исследовании был уделен образцам природного шелка, который в силу его высокой прочности, биосовместимости и биодеградабельности традиционно используется в хирургии.

Отработанные в процессе многолетней клинической практики рабочие режимы электросварочного воздействия в физиологическом диапазоне позволили зарегистрировать следующие структурные события на молекулярном и наноструктурном уровнях.

·  Показано, что при ВЧ-сварке более лабильные глобулярные белки претерпевают тепловую денатурацию: повышение температуры вызывает структурный переход типа «глобула-клубок», в результате чего формируются клееподобные субстанции. Метод склеивания широко распространен в хирургии; для этого используются специализированные медицинские клеи или белковые препараты, которыми покрывают места соединения поврежденных структур, например, альбумином при лазерной коагуляции. Преимущество метода ВЧ-сварки в том, что удается избежать присутствия инородного материала и проблем иммунной несовместимости.

·  Выявлена инертность наноструктурной организации «молекулярных машин», выполняющих в организме специализированные функции (например, сократительная и нервная системы), а также коллагеновых нитей, расположенных в межклеточном матриксе и выполняющих опорную функцию ткани [11], рис. 1-3. Структурная инертность обеспечивает прочность соединения и сохранность функциональных свойств ткани.

(а)	(б)
Рис. 1. Картина рентгеновской дифракции в больших углах (расстояние образец-детектор 46 мм) образцов коллагена крысы: (а) контроль, (б) после воздействия ВЧ-сварки.

·  Под действием ВЧ-сварки выявлен уникальный феномен самосборки разнонаправленных фибрилл с наноструктурной периодичностью в упорядоченный межклеточный матрикс.

·  На гистологических картинах электросварного шва сохраняются волокнистые структуры соединительной ткани: коллагеновые и ретикулярные волокна, базальные мембраны эпителия слизистой оболочки, желез, кровеносных сосудов. Указанные структуры претерпевают изменения под воздействием ВЧ-сварки, но сохраняют характерное строение, и, следовательно, обеспечивают прочность соединения [1].

(а)	(б)
Рис. 2. Рентгенограммы образцов коллагена крысы (расстояние образец-детектор 2435 мм): (а) контроль, (б) после воздействия ВЧ-сварки.

(а)	(б)
Рис. 3. Рентгенограммы образцов нервных волокон (расстояние образец-детектор 290 мм): (а) контроль, (б) после воздействия ВЧ-сварки.

·  Рентгенограммы различных интактных образцов кокона шелка (рис. 4-5) и ткани кишки (рис. 6) мало информационны, они характеризуются интенсивным малоугловым диффузным рассеянием, индикатрисса которого имеет радиальную симметрию; дифракционные линии в области наноструктурной упорядоченности практически не выявляются. Подобные рентгенограммы говорят либо об отсутствии упорядоченности фибриллярных биополимеров, либо свидетельствуют об их незначительной концентрации в ткани.

(а)	(б)	(в)
Рис. 4. Рентгенограммы образцов шелковых нитей шелкопряда Antheraea mylitta (расстояние образец-детектор 46 мм): (а) контроль; (б) после воздействия ВЧ-сварки в режиме 130 в, 10 с; (в) режим 100 в, 5 с.

(а)	(б)
Рис. 5. Рентгенограммы образцов коконов шелка шелкопряда Bombyx mori (расстояние образец-детектор 290 мм): (а) контроль; (б) после воздействия ВЧ-сварки.

После ВЧ-воздействия рентгенограммы сварных швов ткани в области малых углов буквально «набиты» острыми дифракционными кольцами: в наноразмерном диапазоне от 10 до 0.4 нм зарегистрирована серия острых дебаевских колец с основным периодом 4.65 нм [12]. Наноструктурный инвариант 4.65(± 0.15) нм атрибутирован нами ранее как период идентичности, обусловленный регулярным прикреплением олигосахаридных цепей к белковому кору гигантской молекулы протеогликанов слизи и межклеточного матрикса тканей [13]. Феномен появления новых дифракционных линий после ВЧ-электрохирургического воздействия был выявлен нами также на образцах кокона шелка: зарегистрированы многочисленные тонкие дебаевские кольца в диапазоне 5 до 0.5 нм, обусловленные наноструктурной упорядоченностью, молекулярная структура при этом оставалась стабильной. Морфологические изменения на поверхности кокона были незначительные – визуально регистрировался слабый след от сварных электродов.

(а)	(б)
Рис. 6. Рентгенограммы ткани кишки (расстояние образец-детектор 290 мм): (а) контроль; (б) после воздействия ВЧ-сварки.

·  Появление дифракционных линий под воздействием ВЧ-сварки можно объяснить понижением симметрии от сферической до аксиальной, характерной для группы биополимеров, в данном случае для протеогликанов. Снятие вырождения зависит не только от энергетического уровня структурной системы, но и от характера симметрии приложенных воздействий: вектора механических сил или электромагнитного поля. «Рождение» наноструктурной упорядоченности может быть обусловлено изменением элементного состава под действием сварки.

ВЫВОДЫ. Таким образом, преимущества метода высокочастотной электрохирургической сварки при репарации поврежденной ткани могут быть обусловлены следующими процессами. (1) По мере повышения температуры часть жидкости испаряется, эффективная концентрация элементного содержания биополимеров в замкнутой системе растет. (2) Геометрические особенности конструкции инструментов – плоские электроды, напаянные на щипцы – под влиянием механического сжатия создают трехмерную топологию активного пространства с уникальными физическими параметрами, которые могут обеспечить самосборку слоистых наноструктур жидкокристаллического типа. (3) Протеогликановые системы, являясь полидентатными лигандами, проявляют хелатирующий эффект: их комплексы с катионами (например, с Са) характеризуются высоким коэффициентом устойчивости. Катионы Са могут формировать статистические поперечные сшивки с отрицательно заряженными карбоксильными и сульфатными группами, вызывая изменения конформации полисахаридных цепей и вовлекая их в формирование трехмерной сетки. Температура плавления и другие термодинамические параметры полимерных сеток гораздо более чувствительны к незначительному изменению плотности поперечных сшивок, чем к их химической природе. Взаимодействие протеогликанов с катионами можно рассматривать как фактор, обеспечивающий модификационную адаптацию организма к экстремальным внешним воздействиям. На наш взгляд, высокочастотная осцилляция при разных режимах модуляции ВЧ-сварки может противодействовать процессу минерализации тканей.

Повышение эффективности медицинской диагностики – одна из наиболее важных практических задач современной структурной биологии, решение которой основывается на изучении характера отклонений от нормы на различных уровнях биологических структур при заболеваниях и врожденных патологиях. Использование экспериментального потенциала электросварочных технологий и структурных методов на основе синхротронного излучения для решения проблем биологии и медицины является важным ресурсом естествознания нашего времени.

Работы выполняются при поддержке гранта РФФИ № 11-02-00706.

1. «Тканесохраняющая высокочастотная электросварочная хирургия». Атлас. Киев, 2009.

2. Aulchenko V. M., Baru S. E., Gadzhiev A. M., Gerasimov V. S., Korneev V. N. et al. “A small-angle X-ray diffractometry station for high-time - resolution studies using synchrotron radiation sources” Nuclear Instruments and Methods in Phys. Res., 1995, A 359, 216-219.

3. Aul’chenko V. M., Bessergenev A. B., Evdokov O. A., Gerasimov V. S. et al. “The station for time-resolved investigation in wide and small angles of diffraction” Nuclear Instruments and Methods in Phys. Res., 1998, A 405, 487-493.

4. V. N. Korneev, V. A. Shlektarev, A. V. Zabelin, V. M. Aul’chenko et al. “Equipment for Investigations of Biological Nanostructures by Diffraction Methods with Synchrotron Radiation” Glass Physics and Chemistry, 2010, 36(1), 100–109.

5. E. A.Denisova, P. I.Lazarev, A. A.Vazina, L. A. Zhelesnaya “Intestinal mucus and juice glycoproteins have a liquid crystalline structure” Studia biophysica, 1985, 108(2), 117-124.

6. Zheleznaya L. A., Denisova E. A., Lazarev P. I., Vazina A. A. "X-ray diffraction studies on fine structure of mucus glycoprotein" J. Nanobiology, 1992, 1, 107-115.

7. A. M.Aksirov, V. S.Gerasimov, V. I.Kondratyev et al. “Biological and medical application of SR from storage rings VEPP-3 and “Siberia-2”.The Origin of Specific Changes of Small-Angle X-ray Diffraction pattern of Hair and their Correlation with the Elemental Сontain”. Nuclear Instruments and Methods in Phys. Res., 2001, A 470, 380-387.

8. A. A.Vazina, A. Yu. Budantsev, W. Bras et al. “X-ray diffraction and spectral studies of biological native and modified tissues” Nuclear Instruments and Methods in Phys. Res., 2005, A 543, 297-301.

9. A. A.Vazina, W. Bras, I. P.Dolbnya et al. “Peculiarities of human hair structural dynamics” Nuclear Instruments and Methods in Phys. Res., 2005, A 543, 153-157.

10. Vazina, A. A., Lanina, N. F., Korneev et al. “Nanoinvariant of proteoglycan structural order of biological tissues and mucus of gastrointestinal tract” Glass Physics and Chemistry, 2006, 33(3), 294-301.

11. , . Научные труды III съезда физиологов СНГ, 2011, Украина, Ялта, с. 225.

12. , , и др. Материалы 6-го международного научно-практического семинара «Сварка мягких живых тканей. Современное состояние и перспективы развития». Украина, Киев, 2011, с. 53-54.

13. A. A. Vazina, N. F. Lanina, A. A. Vasilieva et al. Nuclear Instruments and Methods in Phys. Res., 2009, A 603, 90-94.