Комплексное исследование сердца крыс при поражении изопротеренолом (стр. 2 )

Для измерения внутриклеточного свободного Са++ в изолированных кардиомиоцитах к клеткам добавляли 1 мкл раствора флуоресцентного Са++ индикатора Fluo-4 (Invitrogen F-14201) и инкубировали в темноте 20 мин при 370 для насыщения клеток индикатором. Далее переносили около 50 кардиомиоцитов в камеру объемом 250 мкл с дном из покровного стекла и помещали её на х63 объектив инвертированного микроскопа. Клетки освещали светом ртутной лампы, используя минимальную интенсивность освещения клеток для снижения их фотоповреждения. Длительность одного сеанса освещения не превышала 20 сек. Флуоресцентный сигнал регистрировали с помощью высокоскоростной цифровой камеры AxioCam HS (Цейсс) со скоростью 50-200 кадров/сек и записывали на жесткий диск компьютера. Для возбуждения клеток использовали электростимуляцию с частотой 1 Гц и напряжением 38 В течение 10 сек.

Гистологическое исследование. В конце опыта из середины боковой стенки ЛЖ вырезали кусочек миокарда и фиксировали с последующим окрашиванием гематоксилином и эозином полутонких срезов. Образцы просматривали под световым микроскопом.

Результаты исследования

Насосная функция

Всего было выполнено 4 серии с применением различных дозировок ИЗО – 85, 120, 150 и 180 мг/мг, каждую дозу вводили дважды с интервалом в сутки.

В первой серии эхокардиографическое исследование было выполнено дважды – через 3 дня и 3 месяца. Через 3 дня частота сокращений, диастолический объём, фракция выброса и степень уменьшения площади ЛЖ остались неизменными, но индекс VTI был достоверно снижен на 27% (таб.1). Проявлялась явная тенденция к снижению минутного объёма, при сопоставлении этой величины только в парных опытах (n=9) разница оказалась статистически достоверной (p<0,05). В дальнейшем почти все эти крысы выжили, и, как можно видеть в таблице, характеризовались повышенной величиной минутного объёма при нормальной фракции выброса, однако сравнение этих групп не вполне правомерно из-за отсутствия адекватного возрастного контроля.

Поскольку введение данной дозировки не привело к развитию явной СН, в дальнейших сериях были применены более высокие дозировки. Исследование сердца крыс, получивших по 120 и 150 мг/кг дважды, было проведено через 2 недели (таб.1). При кумулятивной дозе 240 мг/кг выявилась тенденция к увеличению КДО и КСО, снижению фракции выброса и минутного объёма. Эти изменения проявились более отчётливо при кумулятивной дозе 300 мг/кг. Фракция выброса и минутный объём были достоверно снижены на 14 и 25 % соответственно, параллельно фракции выброса уменьшалась в такой же степени и площадь ЛЖ при систоле, при этом КДО увеличился на 31%. Толщина задней стенки ЛЖ в диастоле и систоле существенно не изменялась, но тенденция к уменьшению степени утолщения стенки при систоле была достаточно явной.

Ещё более значительные изменения наблюдали при использовании самой большой дозы ИЗО 360 мг/кг (таб.2). Через 2 месяца после введения КДО увеличился более чем вдвое, КСО был увеличен в несколько раз, фракция выброса и степень утолщения стенки уменьшились на 32-45% . Тем не менее, минутный объём был снижен незначительно, что говорит о хороших компенсаторных возможностях системы кровообращения.

Эти данные показали, что между объёмом ЛЖ и фракцией выброса существует обратная связь. Расчёт корреляции между КДО и ФВ показал наличие относительно слабой связи в группе контроля и ИЗО-2 (r= –0.49 и –0,50), но эта связь усиливалась в группах ИЗО-3 и ИЗО-4 (r= –0.71 и –0,88, соответственно). В отличие от этого, корреляция между КСО и ФВ была высокой во всех группах (r= –0,86-0,88), что отражает явную зависимость ФВ от степени сокращения волокон ЛЖ в систоле. Данную связь иллюстрирует рис.1 (данные по серии ИЗО-4 не приведены, так как они сильно выходят за пределы шкалы). Однонаправленные и близкие по степени изменения фракции выброса и степени уменьшения площади ЛЖ при систоле нашли своё отражение при расчёте корреляции (r= 0,6 в контроле и 0,80-0,85 в группах ИЗО-2 и ИЗО-3), а также на рис.2.

Фазовый анализ насосной функции после введения 300-360 мг/кг, выполненный отдельно для каждого желудочка, показал, что при формировании сердечной недостаточности происходит закономерное изменение структуры сердечного цикла – удлинение изоволюмических фаз цикла на 24-28% за счёт укорочения фазы наполнения на 14-20% (таб.3). Кроме того, у животных, получивших 360 мг/кг, отмечено и удлинение фазы изгнания на 11%, а также выявлена аналогичная перестройка структуры цикла для правого желудочка.

Укорочение фазы наполнения сердца за счёт удлинения фаз систолы позволяет предполагать, что недостаточное наполнение ЛЖ может послужить одной из причин ослабления сократительной функции сердца под влиянием изопротеренола. Действительно, расчёт корреляции между фракцией выброса и относительной длительностью диастолы позволил установить, что в контрольной группе никакой связи между ними нет, а в группах ИЗО-2, ИЗО-3 и ИЗО-4 прослеживается отчётливая связь (r= 0, 64-0,69-0,69 соответственно).

Таким образом, основными функциональными признаками поражения миокарда под влиянием высоких доз изопротеренола являются: дилатация полости ЛЖ, уменьшение фракции выброса, удлинение изоволюмических фаз сокращения и расслабления, а также сокращение длительности фазы наполнения. В сердцах крыс, у которых введение изопротеренола не привело к дилатации ЛЖ и снижению фракции выброса, единственным достоверным изменением было удлинение изоволюмических фаз на 19%. Принимая во внимание, что длительность изоволюмического расслабления заметно больше, чем сокращения, данный результат позволяет предполагать, что именно расслабление замедлено у животных без признаков СН.

Сократимость и расслабимость

Через 2-3 недели после введения изопротеренола (кумулятивная доза 170 мг/кг) половина животных была подвергнута инвазивному исследованию ЛЖ с применением Милларовского катетера в сочетании с импедансометрией. Результаты технически успешных опытов представлены в таблице 4.

Основные параметры гемодинамики были снижены у получавших изопротеренол крыс – частота сокращений на 10%, а систолическое давление в ЛЖ – на 20%. Снижались и скоростные показатели развития давления - максимальная скорость развития давления - на 30%, а индекс сократимости - на 20%. Изоволюмическое расслабление показало тенденцию к замедлению, а вот ауксоволюмическое расслабление в начальном периоде наполнения было достоверно замедленным – константа скорости была снижена на 30%, а константа времени выше на 39%. Длительность периода предизгнания имела тенденцию к увеличению, а длительность систолы удлинялась соответственно удлинению длительности цикла. Таким образом, при инвазивном исследовании крыс, получавших изопротеренол, были выявлены явные признаки миокардиальной недостаточности – снижение сократимости и расслабимости, причём снижение расслабимости было более выраженным, особенно в фазе начального наполнения ЛЖ.

Результаты следующих серий, в которых были применены гораздо более высокие кумулятивные дозы ИЗО – 240 и 360 мг/кг, подтвердили это наблюдение (таб. 5). В этих сериях были использованы обычные катетеры, поэтому величины максимальной скорости развития и снижения давления в контрольных опытах были значительно ниже прежних, представленных в таб. 4. В обеих сериях опытов с изопротеренолом были получены принципиально сходные результаты, но степень изменений была определённо больше в группе с наибольшей дозой изопротеренола. В группе, получившей 240 мг/кг, систолическое давление в ЛЖ и показатели сократимости не изменялись, но показатели, характеризующие процесс расслабления, были статистически достоверно снижены: индекс расслабимости – на 33%, константа скорости ауксоволюмического расслабления снижена в 2 раза, а константа времени ауксоволюмического расслабления повышена также почти в 2 раза. При этом показатели изоволюмического расслабления показали лишь тенденцию к замедлению.

Сердца крыс, получивших 360 мг/кг ИЗО, характеризовались ещё более глубокими изменениями расслабимости миокарда – наряду со снижением показателей ауксоволюмического расслабления, была также понижена константа скорости изоволюмического расслабления более чем в 2 раза. Эти изменения сочетались со снижением скоростных параметров развития и падения давления на 22-32%, а также производных из них индексов на 24-35%. Следует отметить, что степень снижения показателей расслабления была больше, чем показателей сокращения. В результате ухудшения сократимости и расслабимости миокарда КДД в ЛЖ было явно повышено, а длительность систолы увеличена на 16%.

Корреляционный анализ по всему массиву представленных в таблице 5 данных показал, что между скоростными параметрами сокращения и расслабления существует прямая зависимость (коэффициент корреляции 0,74). Ещё более высокий коэффициент (0,85) характерен для сердец из групп ИЗО. Для индекса сократимости во всём массиве данных характерна обратная корреляция с временем до пика скорости (r = – 0,78) и КДД в ЛЖ (r = – 0,83, рис.3). Близкая корреляция отмечена также между КДД и показателями расслабления (r = – 0,67-0,7). С остальными показателями индекс сократимости коррелировал слабо, исключением были только групп изопротеренола, в которых отмечена хорошая положительная корреляция с максимальной скоростью снижения давления и изоволюмической константой расслабления (r = 0,83 и 0,72, соответственно).

В каждой серии крыс, получавших изопротеренол, показатели сократимости и расслабимости миокарда были снижены по сравнению с контрольными величинами. Однако относительная степень снижения всех показателей процесса расслабления была приблизительно вдвое больше по сравнению с показателями процесса сокращения (рис.4). По парному критерию Стьюдента разница достоверна с высокой степенью точности (p< 0.01), а самая высокая степень достоверности (p< 0.001) отмечена для ауксоволюмической константы расслабления.

Наряду с инвазивными показателями были также измерены некоторые неинвазивные показатели, полученные при анализе импедансного сигнала. Результаты, приведенные в таб. 6, свидетельствуют, что показатель, характеризующий длительность периода электромеханического сопряжения - длительность периода предизгнания, как и время до пика dP/dt, остался неизменным при изопротереноловом поражении миокарда. В отличие от этого, длительность механической систолы отчётливо удлинялась примерно соответственно замедлению частоты сокращений. Длительность систолы по отношению к общей длительности цикла в контрольной группе составляла 53%, а в группах, получавших изопротеренол, - 56%. Широко используемый импедансный показатель сократимости - максимальная скорость систолического изменения Z-сигнала (Z-Vmax) – отчётливо снижался в группе, получившей большую дозу изопротеренола, на 31%, а ускорение (Z-Amax) – почти вдвое. Более чувствительными оказались два других показателя - амплитуда О-волны в импедансном сигнале (Z-O-max) и отношение величины волн О и С, повышавшиеся в 2,5-3 раза и 3,5-4 раза, соответственно.