Комплексное исследование сердца крыс при поражении изопротеренолом (стр. 1 )

Комплексное исследование сердца крыс при поражении изопротеренолом

, , ,

ФГБУ «Российский кардиологический научно - производственный комплекс» Минздрава РФ, Москва 121552 3-я Черепковская 15А;

Факс [phone]; E-mail: v. *****@***ru; Тел. [phone]

Введение

Сердечная недостаточность (СН) является конечным исходом многих заболеваний системы кровообращения. В прошлом веке под СН подразумевали недостаточность именно систолы, т. е. выброса из левого желудочка (ЛЖ), что обычно характеризуется сниженной фракцией изгнания [1]. В нынешнем столетии выделена форма СН с нормальной фракцией изгнания, но нарушенным расслаблением и наполнением желудочка [2-5]. Данную форму предложено обозначать как диастолическая СН. Её отличительными признаками являются замедленное расслабление, повышенное диастолическое давление в ЛЖ, сниженная скорость развития давления. Особенностью данной формы является то, что диастолическая дисфункция, являющаяся ведущим синдромом данной формы СН, может наблюдаться и без наличия систолической СН. Одно из самых простых определений этих форм предложил A. Katz [6] – «систолическая дисфункция характеризует желудочек, ударный объём которого уменьшен из-за нарушенного изгнания, а диастолическая дисфункция характеризует желудочек с нарушенным наполнением».

Значимость диастолической СН определяется тем, что её доля в общем числе случаев хронической СН в настоящее время превышает 50% [7-10]. Существование этой формы породило оживлённую дискуссию. Одни считают, что это две разные формы СН, другие – что диастолическая СН предшествует систолической СН. С физиологической точки зрения разделять систолу и диастолу нельзя, поскольку они регулируются одними и теми же внутриклеточными белками, определяющими транспорт Са++ в кардиомиоцитах [обзоры 11-13]. Ключевым звеном системы ионного транспорта является саркоплазматический ретикулум. Освобождение Са++ из него, вызванное входом внешнего Са++ по медленным кальциевым каналам, через воротный механизм – белок рианодинового рецептора RYR2 позволяет запустить процесс сокращения, а обратный транспорт Са++ из миофибрилл через Са++-АТФазу – белок SERCA2а – запускает процесс расслабления.

Функциональная роль последнего является чрезвычайно важной, потому что от его активности зависит содержание Са++ в ретикулуме и последующая сила сокращения. Такому представлению соответствуют результаты выполненных ранее экспериментов, показавшие, что процесс расслабления изменяется раньше и в большей степени, чем процесс сокращения, под влиянием разнообразных физиологических факторов – действии катехоламинов, при умеренном увеличении притока к сердцу, частоты сокращений или концентрации Са++ в перфузате [1, 14]. Это позволяет думать, что именно изменения процесса удаления Са++ из миоплазмы являются ведущими для определения сократимости миокарда.

При действии патологических факторов ситуация гораздо менее ясна. Данная тема служила предметом многих исследований, выполненных преимущественно в прошлом веке. Хроническая СН характеризуется глубоким нарушением и сокращения, и расслабления миокарда. Однако последовательность нарушения этих процессов проследить удаётся редко, хотя важно выяснить, какие же белки и регулируемые ими процессы повреждаются прежде всего. Это позволило бы прицельно искать эффективные средства профилактики и терапии.

В настоящее время совершенствование традиционных и создание новых методов исследования позволяет получить новые данные о механизме саморегуляции сократительной функции сердца. Поскольку в физиологических условиях изменения процесса расслабления определяют последующие изменения сокращения миокарда, естественным выглядит предположение, что и в патологических условиях его роль может быть ведущей [15]. Эта гипотеза легла в основу данной работы. В работе в качестве повреждающего фактора мы использовали агонист бета-рецепторов изопротеренол, действие которого сопровождается повреждением миокарда вследствие множественных микронекрозов [16] и дозозависимым нарушением гемодинамики [17].

Методика исследования

Опыты выполняли на наркотизированных кетамином (100 мг/кг) самцах крыс Вистар массой 400–450 г. Всего было выполнено 4 серии экспериментов, в которых доза изопротеренола варьировала от 85 до 180 мг/кг, которые вводили дважды с суточным интервалом. Смертность в этих сериях колебалась от 15 до 40%. Выжившие животные и контрольные к ним были исследованы с применением различных неинвазивных и инвазивных методов, причём некоторые группы были исследованы всеми методами.

Эхокардиография. Исследование функции сердца наркотизированных крыс выполняли на аппарате iE33 (Philips Ultrasound, Bothell WA, USA) с использованием датчика S12-4 (12-4 MГц). Конечно-диастолический и конечно-систолический размеры левого желудочка (ЛЖ), а также толщину задней стенки ЛЖ измеряли в М-режиме из парастернального доступа в проекции длинной оси сердца; площадь поперечного сечения ЛЖ в конце диастолы (Sd, см2) и в конце систолы (Ss, см2) определяли из парастернального доступа в проекции по короткой оси сердца на уровне папиллярных мышц, рассчитывая процент изменения площади поперечного сечения ЛЖ в систолу по следующей формуле: ΔS%= (Sd - Ss)/ Sd х 100. Объемы ЛЖ (КДО, КСО) и фракцию выброса определяли с использованием модифицированного алгоритма Симпсона из апикального доступа в трёх проекциях (4-х и 2-х камерных и по длинной оси ЛЖ). Интеграл линейной скорости кровотока (VTI, см) – эквивалент ударного объема, а также ударный объем ЛЖ (УО, мл) и сердечный выброс (МО, мл/мин) определяли с помощью допплеровского исследования в импульсном режиме на уровне выходного тракта ЛЖ.

Катетеризация. У наркотизированных кетамином (100 мг/кг) животных непрерывно регистрировали ЭКГ во 2-м стандартном отведении, среднее артериальное давление (АД), давление в левом желудочке (ЛЖ) и тетраполярную импедансную кардиограмму (ИКГ). В яремную вену вставляли катетер для введения веществ. Для регистрации давления в ЛЖ и аорте использовали Милларовский прецизионный микроманометр на конце тонкого (диаметр – 0,53 мм) катетера (SciSense Instruments, Канада), введенный через сонную артерию, и тензометрический усилитель Hugo Sachs Elektronik (Германия). Артериальное давление через катетер в бедренной артерии измеряли с помощью электроманометра Gould Statham P23 Db (CША). Для регистрации ИКГ вводили подкожно токовые электроды-иглы в области нижней челюсти и одной из нижних конечностей, а сигнальные по верхней и нижней границе грудины. Сигнал ИКГ (ΔZ) регистрировали с помощью модифицированного для работы с мелкими лабораторными животными реоплетизмографа РПКА-2-01 (Медасс, Россия) с расширенной полосой пропускания (от 0,1 до 150 Гц при несущей частоте 40 кГц и амплитуде импульсов тока 3.5 мА).

Сигналы ЭКГ, давления в левом желудочке и аорте подавали на «Biograph-4» (Cанкт-Петербургский государственный университет аэрокосмического приборостроения). Измеряли традиционные показатели сократимости – максимальную скорость развития давления (dP/dtmax) и индекс Veragut & Krayenbuhl [18] (dP/dtmax/P - давление в момент достижения максимума dP/dt). Для характеристики процесса расслабления использовали максимальную скорость снижения давления (dP/dtmin), а также производный из неё индекс расслабимости по аналогии с индексом сократимости. Кроме того, вычисляли константы скорости снижения давления в изоволюмической [19] и ауксоволюмической [20] фазах.

Все сигналы оцифровывали с частотой 1 кГц с помощью аналого-цифрового преобразователя NI-USB-6210 («National Instruments», США) и записывали на жесткий диск компьютера. Для записи и обработки физиологических сигналов были разработаны собственные программы (автор - Е. В.Л.). Величины всех параметров рассчитывали на основе анализа записей первичных сигналов, подвергнутых предварительной процедуре пульс-синхронного усреднения, которая обеспечивает автоматический расчет “усредненных форм” сигналов по 40 кардиоциклам каждые 5 с. Для этого сначала производили интерполяцию и переоцифровку сегментов ЭКГ-сигнала, содержащих QRS комплекс, с шагом 0,2 мс, что необходимо для точного определения положения вершины R зубца в каждом кардиоцикле. Затем все фрагменты пульсовых волн исследуемых сигналов синхронизовали, совмещая во времени вершины R зубцов.

Синхронизированные по R зубцу сигналы подвергали медианной фильтрации для удаления помех и сильно отличающихся по форме или амплитуде волн. Полученные семейства кривых усредняли и рассчитывали первые и вторые производные сигналов ΔZ и давления, применяя метод полиномиальной фильтрации-дифференцирования Савицкого-Голаи. Чтобы обеспечить аккуратность оценки амплитуд максимумов производных этих сигналов и необходимое разрешение при измерении соответствующих временных интервалов, снова применяли интерполяцию с переходом к дробному шагу 0,1 мс. В результате получали хорошо воспроизводимые кривые с минимумом помех и разрешением во времени до 0,1 мс, несмотря на сравнительно небольшую частоту аппаратной оцифровки (шаг 1 мс). Расчет ЧСС производили каждые 5 с по средней длительности RR интервалов для каждого из наборов кардиоциклов. Для неинвазивной оценки сократимости ЛЖ использовали измерение длительности периода предизгнания (ДПП, в мс) по методу [21]. Эту величину определяли по сигналу ИКГ – от вершины зубца R до максимума второй производной импедансного сигнала (d2Z/dt2)max, а при записи давления в ЛЖ величину ДПП измеряли от зубца R до максимума скорости повышения давления (dP/dtmax )(по Siegel [22]).

Изолированные кардиомиоциты. За 15 минут до выделения сердца крысе вводили гепарин ( 5 ед/г веса животного, в/б). После декапитации и вскрытия грудной клетки сердце иссекали и немедленно подвешивали на канюлю с перфузией по Лангендорфу, длительность перфузии бескальциевым раствором (содержание остаточного Са++ не более 50 μМ) составляла 30 минут. В течение этого этапа происходило вымывание Са2+ из межклеточных пространств. Затем перфузировали сердце раствором коллагеназы CLS2 (325U/mg) в замкнутом цикле 20 минут. Затем миокард измельчали, удаляли супернатант с коллагеназой, оставляя осадок с живыми кардиомиоцитами, и добавляли раствор альбумина с 0,1 мМ Са++. В зависимости от исходного количества миокарда, взятого для выделения клеток, получали 5-10 миллионов жизнеспособных кардиомиоцитов для исследований. Выделенные клетки инкубировали в камере экспериментальной установки в нормоксическом буфере Тироде, аэрированным карбогеном при 37о в течение 1-2 часов, осуществляя постоянную продувку пространства камеры над раствором карбогеном.