ОЦЕНКА УРОВНЕЙ АРГИНИНА И ПРОДУКТОВ NO-СИНТАЗ У пациентов перенесших инфаркт В УСЛОВИЯХ ГИПЕРГОМОЦИСТЕИНЕМИИ
Цель исследования. В настоящем исследовании проведена оценка продуктов NOS в виде суммы нитратов, нитритов и нитрозотиолов при ГГЦ у больных перенесших инфаркт. Поскольку в условиях ГГЦ наблюдается торможение NO-синтазной реакции, представляется важным установить, насколько уровень этих продуктов зависит от субстрата NOS - циркулирующего аргинина и зависимость содержания самого аргинина от уровня ГГЦ.
Известно, что при гомоцистеинемии наблюдается торможение NO-синтазной (NOS) активности в эндотелиоцитах. В качестве субстрата для синтеза NO используется незаменимая аминокислота аргинин. Не смотря на то, что в печени образуется большое количество аргинина из орнитина и активированного аммония, полученный аргинин не способен покинуть гепатоциты и восполнять потребности аргинина в других тканях. Однако, небольшое количество аргинина ресинтезируется в ткани почек из цитрулина. Цитрулин, в свою очередь, возникает в тканях кишечника и в местах локализации NOS реакции, включая эндотелиоциты.
Включение в анализ суммарного содержания продуктов NOS наряду с нитратами и нитритами S-нитрозотиолов, более полно отражает образование и выведение продуктов превращения оксида азота в организме. Большое внимание последнее время начали уделять нитрозотиолам, в качестве обратимо депонированной формы оксида азота, и, в связи с поиском лабораторного клинико-диагностического критерия состояния NO-синтазной активности в качестве одного из показателей эндотелиальных дисфункций.
По-видимому, выявляемое содержание нитрозотиолов в образце плазмы крови может зависеть от исходного их уровня, аэрации пробы крови, окислительно-восстановительного состоянии плазмы крови, абсолютного уровня тиоловых групп железо - и медь-содержащих белков. Определенный вклад в варьирование данных по анализу суммы окислов азота и нитрозотиолов могут также вносить S-нитрозотиолы гемоглобина, в зависимости от концентрации кислорода. Из-за указанных причин, содержание нитрозотиолов после взятия крови и приготовления плазмы может изменяться в концентрациях от нескольких микромолей и выше. Эта ситуация затрудняет интерпретацию получаемых данных, как относительно варьирования в плазме крови самих нитрозотиолов, так и в отношении суммарного содержания продуктов NO-синтазных активностей.
Известно, что промежуточные гипергомоцистеинемии (ГГЦ) характерны для лиц с прогрессирующими эндотелиальными дисфункциями и атерогенезом. Гомоцистеин (Гци), как и оксид азота, способен приводить к модификации серы белков, в частности, альбумина. Работ, посвященных влиянию Гци на уровень суммарного содержания продуктов NOS и связыванию их белками, явно недостаточно для понимания взаимосвязи между этими конкурентами за положения тиолат-аниона в белках.
Торможение NOS под влиянием гомоцистеина в настоящее время связывают не с изменением количества эндотелиальной NOS за счет торможения экспрессии генов, а с ингибированием за счет ассиметричного диметиларгинина (АДМА), накапливающегося в эндотелиоцитах. Механизм этого явления, по-видимому, состоит в том, что гомоцистеин в клетке превращается в S-аденозилгомоцистеин - мощный ингибитор диметиларгинин-диметиламиногидролазы (ДДАГ).
Не следует останавливаться на объяснении снижения концентрации продуктов NO-синтаз только за счет снижения их синтеза. Возможно, что при образовании низкомолекулярных нитрозотиолов, в том числе гомоцистеина, наблюдается уменьшение их доли связывания с белками и, соответственно, более высокая экскреция, т. к. низкомолекулярный нитрозотиол гомоцистеина не имеет препятствий для клубочковой фильтрации в отличие от гомоцистеинилированных белков.
К настоящему времени следует говорить лишь о тенденции к снижению уровня NOX, обнаруженного в данной работе у постинфарктных пациентов, получавших лечение нитратами. Как известно, гомоцистеин плазмы в основном находится в состоянии смешанного дисульфида с белком. Предположение о роли эндогенных форм и фармаконитратов в выведении гомоцистеина из общего кровотока нуждается в дальнейшей проверке.
Данных, позволяющих сравнить уровни продуктов NO-синтазных активностей и АДМА при прогрессировании отрицательных проявлений ГГЦ все еще недостаточно. В значительной степени это может быть связано с отсутствием общепринятых методик анализа продуктов NOX. Предложения о способах регистрации уровня NOS-активности к настоящему времени сместились от анализа нитратов и нитритов к анализу S-нитрозотиолов. Данные по анализу нитрозотиолов вызвали обширную дискуссию в среде клинических биохимиков. Какова истинная концентрация нитрозотиолов в плазме крови – это десятки наномоль/л, микромоль/л или десятки мкмоль/л. Источником дополнительных количеств любого из окислов азота могут быть связанные с гемоглобином эритроцитов запасы NO. Наряду с этим, справедливо указано на то, что для анализа нитрозотиолов не следует применять агенты, блокирующие эндогенные тиолы, так как последние препятствуют их спонтанной декомпозиции и окислению. По указанным причинам режим приготовления плазмы крови даже при взятии крови в одинаковых условиях натощак может оказать большое влияние на конечные результаты анализа.
Методы исследования
Группы обследованных пациентов и субъектов
Девять мужчин без вредных привычек в возрасте 23-24 года составили контрольную группу. 65 пациентов из них 23 мужчины и 42 женщины (в возрасте от 38 до 58 лет) составили группу поликлинического приема, случайно выбранных при обращениях вследствие артериальной гипертензии.
Другие обследованные составили основные группы, проходившие лечение в кардиологической клинике кафедры факультетской терапии СПбГМУ им. Росздрава (зав. кафедрой, директор Института кардиологии им , Росздрава, членкор РАМН, профессор ). 25 мужчин, перенесших инфаркт три месяца назад, в возрасте 39-59 лет и шесть мужчин, перенесших инфаркт три месяца назад, в возрасте от 66 до 68 лет, кроме того еще одна группа сравнения из 9 здоровых мужчин в возрасте от 35 до 50 лет. До участия в исследовании у каждого субъекта было получено информированное согласие.
Кровь из вены натощак от здоровых доноров и пациентов собирали в охлаждаемые пробирки с ЭДТА. Пробирки с кровью постоянно находились во льду и были в работе не более 20 мин. После центрифугирования при 1500 об/мин в течение 7 мин, прозрачная плазма была отделена и хранилась до использования при −80 ◦C.
Спектрофотометрическое определение концентраций продуктов NO-синтазной реакции и аргинина в плазме крови проводили в отделе биохимии НИЦ СПбГМУ им. Росздава.
Количественное определение нитратов и нитритов, проводимое на основе реакции Грисса, широко используется для оценки продуктов NO-синтазной активности [19-22]. Для перевода нитратов в нитриты нами использован предложенный ранее в работе [19] порошок металлического цинка («Вектон», С.-Петербург, Россия). Для этого, 0,5 мл образца плазмы и такой же объем раствора нитратов с известной концентрацией разводили равным объемом воды, перемешивали и приливали 1 мл 20% раствора охлажденной ТХУ для осаждения белков. После охлаждения до 2-4 oC осадок отделяли центрифугированием при 3000 оборотах в минуту в течение 10 минут. В каждый исследуемый образец после депротеинизации добавляли 0,5 мл 20% раствора аммония хлорида, 0,5 мл раствора 0,1М HCl и 100 мг порошкового цинка. После чего, пробы помещали во встряхиватель «Rotamix» (RM-1, Sky Line, Elmy LTD, Riga, Latvia) и интенсивно перемешивали, пользуясь встроенной программой F9 в течение 10 мин. Для отделения осадка цинка пробы центрифугировали при 2000 оборотах в минуту в течение 2 мин. Надосадочную жидкость переносили в другие пробирки с 0,5 мл 0,5 г/л реактива Грисса, растворенного в 30% уксусной кислоте. Пробы перемешивали и оставляли в темноте при комнатной температуре на 20 мин. Измерение экстинкции проводили на спектрофотометре СФ-46 «ЛОМО» С.-Петербург. Сумму нитратов и нитритов рассчитывали по калибровочным данным, полученным с использованием растворов с известной концентрацией, как нитритов, так и нитратов.
Сумму нитратов нитритов и нитрозотиолов (NOX) определяли в плазме крови основных групп обследованных. Для декомпозиции нитрозотиолов использовали ртутьорганическое соединение парахлормеркурибензоат натрия (ПХМБ) вместо хлорида ртути. Анализ NOX отличался тем, что до добавления ТХУ, плазму крови или раствор стандарта, разводили не водой, как в анализе суммы нитратов и нитритов, а 10мМ раствором ПХМБ. После чего реакционную смесь перемешивали и выдерживали при комнатной температуре 10 мин. Далее анализ вели так же, как и анализ суммы нитратов и нитритов. Определение уровня аргинина в плазме крови осуществляли общепринятым методом Сакагучи.
Анализ гомоцистеина
Общий гомоцистеин плазмы крови определяли отделе биохимии НИЦ СПбГМУ им. Росздава. Процедура пробоподготовки анализа аминотиолов плазмы крови, заключается в следующем: 0,1 мл плазмы крови смешивают с 0,05 мл калий фосфатного буфера рН 8,0 или 0,05 мл калибрующего раствора (20mмоль/л глутатион или пенициламин) и 0,02мл ДTT 10мМ, растворенного в калий фосфатном буферном растворе pH 8,0; инкубируют 10минут при +60 °C. В каждую реакционную смесь добавляют 0,1мл 0,05М ДTНБ и после интенсивного перемешивания инкубируют при комнатной температуре 5 минут. Затем приливают 0,15 мл 9% сульфосалициловой кислоты, приготовленной на растворе 0,2мМ ЭДТА. Осажденные сульфосалициловой кислотой белки после охлаждения инкубационной смеси при - 25° С в течение 5 минут отделяют центрифугированием в течение 5 минут при 8000g. Полученную надосадочную жидкость фильтруют через фильтр c диаметром пор 0,2-0,5 мкм и вносят в хроматографическую систему.
Для хроматографического определения общего гомоцистеина в плазме крови использовали хроматограф Agilent-1100 («Agilent Technologies», Германия). Хроматографию проводили через термостатированную при 30оС колонку с обращеннофазным сорбентом ZORBAX Eclipse XDB C8, 5мкм, 4,6 x 150мм. Хроматографический процесс с использованием колонки С8 состоял из трех фаз: изократическое разделение аминотиолов, регенерация и уравновешивание колонки. В начале подавали подвижную фазу, состоящую из 9% ацетонитрила и 91% 0,1M однозамещенного калий фосфатного буферного раствора с рН 3,76-3,78. В течение 4,7 минуты скорость подвижной фазы поддерживали на уровне 0,8 мл/мин. Затем скорость увеличивали до 1,8 мл/мин и ацетонитрил в количестве 9% смешивался с водой до 6,1 минуты. Затем, до 7 минуты, количество ацетонитрила в подвижной фазе повышали до 50%, что позволяло провести регенерацию колонки. Затем, до11минуты проводили уравновешивание колонки стартовым буфером. Очередной цикл хроматографического разделения в режиме последовательного ввода проб автоматически начинался через 12 мин после начала предыдущего. Объем пробы, который вводили в колонку, составлял 10 мкл и температура в колоночном отделении термостата поддерживалась при 30oC. Производные тионитробензоатов гомоцистеина и других аминотиолов детектировали при длине волны 330 нм.
Эндотелий-зависимая вазодилятация (FMD)
Пациентов обследовали после кратковременного в течение 20 мин отдыха в комфортном тихом помещении в положении лежа на спине. Для процедуры использовали ультрозвуковое зондирование в клинике факультетской терапии СПбГМУ им. Павлова Зосздрава при 7,5 МГц, позволившее получить высококачественные изображения сосуда (GE Vingmed CFM 800, Sonotron). Сканирование сосуда производили в продольном сечении в области локтевой ямки.
Результаты
Средний уровень NOX у здоровых субъектов старшей группы (44,9 ± 5,3 лет) и перенесших инфаркт (49,5 ± 6,38 лет, n = 25; 66,5 ± 1,22 лет, n = 6), выявленный в данном исследовании в плазме крови обследованных натощак, был примерно одинаковым. Суммарное содержание NOX у молодых доноров в возрасте 23 – 24 года было примерно на 75% ниже, чем в основной группе 25 больных перенесших инфаркт и на 96%, - чем в старшей возрастной группе здоровых доноров.
В плазме крови 65 гипертоников не выявлено коррелятивной связи между суммарным уровнем высших окислов азота и общего гомоцистеина. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что уровень индивидуальных продуктов превращения оксида азота может зависеть не только от суммарной активности NOS, но и от условий взятия крови и приготовления плазмы, хранения образца плазмы и наличия в плазме крови больших или меньших количеств переходных металлов, эндогенных аминотиолов, аскорбата и суммарного окислительно-восстановительного равновесия.
При анализе суммарного содержания нитритов нитратов и S-нитрозотиолов их содержание в основной группе 25 пациентов, перенесших инфаркт, связано с уровнем общего гомоцистеина. В этой группе обследованных уровень общего гомоцистеина только у одного пациента был ниже референтного значения нормы – 12 mмоль/л, у остальных колебался от 14,9 до 31,2 mмоль/л. При повышении общего гомоцистеина в крови у этих пациентов наблюдается снижение NOX. У этих пациентов также обнаружена положительная корреляционная связь между эндотелийзависимой вазодилятацией (FMD) и уровнем NOX. Таким образом, способность к эндотелийзависимой вазодилятации сопровождается более высоким уровнем продукции NOX. Представленные экспериментальные данные свидетельствуют в пользу того, что после взятия и хранения образцов плазмы крови следует анализировать сумму NOX, включая нитрозотиолы. Возможно, что именно благодаря этому, в настоящем исследовании выявлена обратная корреляция содержания этих продуктов и оГци.
При анализе содержания аргинина в контрольной группе была обнаружена достоверная положительная корреляционная связь с общим уровнем гомоцистеина. В этой же группе корреляции между содержанием аргинина и NOX найдено не было.
Выявленная положительная корреляция в группе доноров между аргинином и оГци требует дальнейшего изучения. Не исключено, что в старших возрастных группах для обеспечения регуляции NO-зависимых функций требуется более высокий уровень транспорта субстрата NOS в клетку, на фоне снижения эффективности транспортной системы (преимущественно так называемой системы y+ - переносчиков). В этих случаях активность NOS может быть повышена за счет увеличения аргинина в плазме крови.
У здоровых доноров при повышении уровня гомоцистеина в крови обнаруживается повышение уровня аргинина, тогда как в группе пациентов, имевших промежуточную форму ГГЦ, такого эффекта при анализе корреляции внутри группы не выявлено. Следует отметить, что содержание аргинина в среднем в группе больных, перенесших инфаркт, так же как и уровень гомоцистеина, оказался несколько выше, чем в группе здоровых. Таким образом, тенденция к росту гомоцистеина и аргинина в плазме крови сохраняется и в группе больных при сопоставлении средних значений групп. Этот эффект возможно связан с тем, что повышение образования гомоцистеина вызывает некоторое торможение генерации аргинина за счет снижения его потребления в NO-синтазных реакциях.
