Статья по материалам доклада на конференции «Современные проблемы химической технологии биологически активных веществ». РХТУ им. . 26.05.2016 г.
Публикация доступна для обсуждения в рамках функционирования постоянно
действующей интернет-конференции “Бутлеровские чтения”. http:///readings/
Поступила в редакцию 30 июня 2016 г. УДК 543.52+615.074.
Исследование новообразования алифатических спиртов
группы C1-C5 в биологическом материалеи изучение
динамики их концентраций в постмортальном периоде
© Долгов1 Кирилл Сергеевич и Киричек1, 2*+ Александр Васильевич
1 Кафедра «Экспертиза в допинг - и наркоконтроле». Российский химико-технологический университет им. . Ул. Героев Панфиловцев, 20. Москва, 125480. Россия.
E-mail: *****@***com
2 Отдел судебно-химической экспертизы. 111 Главный государственный центр судебно-медицинских и криминалистических экспертиз Министерства обороны Российской Федерации. Госпитальная площадь, 3. Москва, 105229. Россия. Тел.: (499) 263-57-98. E-mail: *****@***ru
_______________________________________________
*Ведущий направление; +Поддерживающий переписку
Ключевые слова: спирты, новообразование спиртов, токсикология спиртов, эндогенный алкоголь, спирты в биообъектах, парофазный газохроматографический метод, динамика концентраций.
Аннотация
Сегодня критерии алкогольной интоксикации при освидетельствовании живых лиц разработаны достаточно подробно. Что касается методики такой экспертизы при вскрытии трупов, то здесь имеется ряд разногласий и остается немало вопросов, требующих разрешения, среди которых – распределение алкоголя в организме, оценка и трактовка результатов судебно-химического исследования в зависи-мости от давности наступления смерти и изменения с течением времени концентрации этанола в изолированном трупном материале. Каждый год проводятся исследования в данной области. Но до настоящего времени относительно метанола и спиртов группы С3-С5 подобных исследований не проводилось. В статье описано исследование новообразования алифатических спиртов – метанола и группы С3-С5в крови и мышце.
Введение
Проблема диагностики алкогольной интоксикации постоянно привлекала внимание судебных медиков, она всегда была, остается и будет актуальной. Как позывает практика, этиловый алкоголь нередко обнаруживается в трупах лиц, погибших насильственной смертью или же умерших скоропостижно [1].
Сегодня критерии алкогольной интоксикации при освидетельствовании живых лиц раз-работаны достаточно подробно. Что касается методики такой экспертизы при вскрытии трупов, то здесь имеется ряд разногласий. Остается еще немало требующих своего разре-шения вопросов, среди которых – распределение алкоголя в организме, оценка и трактовка результатов судебно-химического исследования в зависимости от давности наступления смерти и изменения с течением времени концентрации этанола в изолированном трупном материале [2, 3].
Многочисленными исследованиями было установлено, что на различных стадиях пос-мертного периода содержание этанола в органах и изолированных объектах трупа может как повышаться, так и снижаться вплоть до полного исчезновения [4, 5].
Относительно метанола и спиртов группы С3-С5 подобных исследований не проводилось. В литературе имеются сведения о фармакодинамике, распределении в органах и тканях трупа, токсикологические данные и ряд других. Однако не приводятся практические рекомендации для проведения данного вида экспертиз, поэтому проведение исследований в данной области является актуальным.
Обстоятельства дела и экспертиза, проведенная в 111 Главном государственном центре судебно-медицинских и криминалистических экспертиз Министерства обороны Российской Федерации, из постановления которого известно, что «в грунте на глубине 1.3 метров обна-ружен труп женщины, имеющий явные признаки гнилостных изменений». В представленных биообъектах (мышца, печень, почка) были обнаружены этиловый и бутиловый спирт. В мышце обнаружен этиловый спирт в концентрации 0.32%. В мышце, печени и почке обнаружен бутиловый спирт в концентрации: в мышце – 0.400 г в 1 кг мышцы, в печени – 0.320 г в 1 кг органа, в почке – 0.243 г в 1 кг органа. Было решено, что результаты исследования имеют относительное значение в связи с гнилостным изменением биоматериала.
Экспериментальная часть
В работе был применен метод парофазного газохроматографического исследования в статичес-ком варианте [6]. Исследование проводили на приборе фирмы Agilent Technologies модель 6890-5973N (США) с анализатором паровой фазы Gerstel MPS 2, оборудованном капиллярной колонкой HP FFAP длиной 50 м и внутренним диаметром 0.32 мм. В качестве газа-носителя использовали гелий. Темпе-ратура колонки программировалась от 60 °С до 190 °С со скоростью 10 °С/мин. Температура инжек-тора и интерфейса составляли 180 и 190 °С, соответственно. Ввод парогазовой пробы объемом 250 мкл осуществляли методом без деления потока газа-носителя (splitless). Перед введением в колонку хрома-тографа пробы термостатировали при температуре 90 °С в течение 10 минут при постоянном пере-мешивании в термостате приставки MPS 2. Масс-спектрометр работал в режиме снятия масс-спектров в диапазоне от 20 до 280 m/z.
Для качественного исследования на новообразование спиртов были взяты образцы крови (как живых лиц, так и трупов), ткани желудка, почек, мышц, печени, изначально не содержащие спиртов и оставлены на хранение in vitro в холодильной камере при температуре 4-6 °С.
Во флаконы, содержащие по 1.0 г натрия хлорида, вносили навески измельченных частей ткани мышцы, печени, почки и желудка в количестве по 1.0 г, кровь по 1 мл, герметично закрывали, затем тщательно перемешивали на плоском встряхивателе фирмы IKA модель HS 260 basic.
Количественное определение проводили методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием. Расчеты проводили методом внешнего стандарта. Ввиду того, что ткани и кровь человека содержат эндогенный этанол, калибровку производили по мышечной ткани и крови кролика. Количественное определение спиртов С3-С5 проводили в мышечной ткани человека и образцах крови.
После проведения хроматографирования масс-спектры, соответствующие вершинам хроматогра-фических пиков, сравнивали по стандартной методике с масс-спектрами библиотек «PMW_TOX3», «NIST02» и «Wiley7N». Масс-спектры считали идентифицированными при совпадении масс-спектров исследуемого вещества с библиотечным с коэффициентом подобия, рассчитанным по стандартной методике, превышающим 80%.
Результаты и их обсуждение
1. Качественное исследование
Результаты качественного исследования (образцов тканей органов человека), занесены в сводные табл. 1-2. При изучении учитывался срок хранения in vitro, а также гендерно-возраст-ные признаки.
Результаты качественного исследования образцов крови занесены в сводную табл. 3.
Табл. 1. Учитываемые факторы
Образец ткани | Срок хранения in vitro, мес. | Пол человека | Возраст человека, лет |
Мышца №1 | 12 | Жен. | 63 |
Мышца №2 | 5 | Муж. | 41 |
Мышца №3 | 6 | Муж. | 37 |
Печень №1 | 8 | Муж. | 19 |
Печень №2 | 15 | Муж. | 32 |
Печень №3 | 5 | Муж. | 26 |
Почка №1 | 4 | Муж. | 26 |
Почка №2 | 16 | Муж. | 32 |
Желудок | 4 | Муж. | 26 |
При судебно-химическом исследовании тканей органов человека, хранящихся в холо-дильной камере различные периоды времени, были обнаружены следующие спирты, изна-чально не содержащиеся в данных образцах (за исключением этилового спирта, как эндоген-ного в биологическом материале): этанол, н-пропанол, изо-пропанол, бутанол-2, изо-бутанол, н-пентанол, изо-пентанол.
Табл. 2. Результаты качественного исследования образцов тканей органовна новообразование спиртов группы С1-С5 | Табл. 3. Результаты качественного исследования образцов кровина новообразование спиртов группы С1-С5 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
При судебно-химическом исследовании крови, хранящейся в холодильной камере раз-личные периоды времени, были обнаружены следующие спирты, изначально не содержа-щиеся в данных образцах (за исключением этилового спирта, как эндогенного в биологи-ческом материале, но в меньших количествах, чем после гниения): этанол, н-пропанол, изо-пропанол, бутанол-2, изо-бутанол, изо-пентанол, н-пентанол.
В образцах крови, отобранных у живых лиц, новообразования спиртов группы С1-С5 не выявлено (проанализировано >150 образцов). Нами было сделан вывод о том, что добавление консерванта гепарина (либо цитрата натрия) в образцы крови, с целью предотвращения свер-тываемости, также предотвращает новообразование спиртов.
На примере типичной хроматограммы парогазового экстракта из печени, изначальной не содержавшей метанола, пропанола, бутанола, пентанола и их изомеров и хранившейся при температуре 4-6 °С в течение 6 месяцев (рис. 1) – пики с временами удерживания 5.04 мин. (изо-пропанол), 5.15 мин. (этанол), 6.13 мин. (бутанол-2), 6.33 мин. (н-пропанол), 6.97 мин. (изо-бутанол), 8.36 мин. (изо-пентанол).
|
Рис. 1. Пример хроматограммы парогазового экстракта из ткани печени, хранившейся при температуре 4-6 °С в течение 6 месяцев |
Во всех образцах трупной крови было выявлено новообразование спиртов группы С2-С5.
|
Рис. 2. Фрагмент хроматограммы парогазового экстракта из образца трупной крови. Времена удерживания: 5.15 мин. (этанол), 6.13 мин. (бутанол-2), 6.33 мин. (пропанол). |
На рис. 3 представлена типовая хроматограмма образца крови живого человека, хранив-шаяся в холодильной камере 12 месяцев.
|
Рис. 3. Типовая хроматограмма парогазового экстракта из образца крови живого человека (содержащая консервант гепарин), время удерживания 3.19 мин. соответствует воздуху |
2. Количественное определение
Возможность применения газовой хроматографии для количественных определений обусловливается наличием тесной связи между сигналом детектора и количеством выходя-щего из колонки вещества.
Количественное определение проводили методом газовой хроматографии с масс-селек-тивным детектированием (ГХ-МС). Расчеты проводили методом внешнего стандарта.
Для построения калибровочных графиков были приготовлены по 8 модельных растворов каждого из 5 спиртов (н-пропанол в растворе воды; спирты н-бутанол, изо-бутанол, н-пен-танол, изо-пентанол в циклогексане) с концентрациями: 500.0 нл/мл, 250.0 нл/мл, 125.0 нл/мл, 62.5 нл/мл, 31.3 нл/мл, 15.6 нл/мл, 7.8 нл/мл, 3.9 нл/мл (концентрации спиртов в г/мл раство-рителя указаны в табл. 4). От каждого из растворов были отобраны аликвоты по 1 мкл, пере-несены в виалу вместимостью 20 мл с добавленным ранее хлоридом натрия в количестве 1 г. Калибровка проводилась раздельно на образцах мышечной ткани (по 1 г) и крови (по 1 мл) кролика.
Количественное определение проводили методом хромато-масс-спектрометрии по сле-дующим ионам: а) для н-пропанола 31.2 (в качестве подтверждающих 59.2, 42.2, 29.2), б) для н-бутанола 56.2 (в качестве подтверждающих 41.2, 31.2, 43.2), в) для изо-бутанола 43.2 (в качестве подтверждающих 41.2, 33.2, 39.2), г) для н-пентанола 42.2 (в качестве подтверж-дающих 55.2, 70.2, 41.2), д) для изо-пентанола 55.2 (в качестве подтверждающих 70.2, 41.2, 57.2). Каждую концентрацию измеряли с применением автоматического дозатора образцов трижды. Строили калибровки зависимости площади хроматографического пика характеристи-ческих ионов каждого спирта от количества добавленного спирта. В рассмотренном диапа-зоне концентраций графики калибровочной зависимости линейны.
На рис. 4 приведены примеры калибровочных графиков каждого спирта на двух различ-ных матрицах (мышечная ткань и кровь).
Табл. 3. Концентрации модельных растворов спиртов
Концентрации спиртов, нл/мл р-ля | Концентрация, г/мл растворителя·10-5 | ||||
н-пропанол | н-бутанол | изобутанол | н-пентанол | изопентанол | |
500 | 40.30 | 40.60 | 40.2 | 40.6 | 40.6 |
250 | 20.10 | 20.30 | 20.1 | 20.3 | 20.3 |
125 | 10.10 | 10.10 | 10.1 | 10.1 | 10.2 |
62.5 | 5.03 | 5.07 | 5.03 | 5.07 | 5.08 |
31.3 | 2.52 | 2.54 | 2.52 | 2.54 | 2.54 |
15.6 | 1.26 | 1.27 | 1.25 | 1.27 | 1.27 |
7.8 | 0.63 | 0.63 | 0.63 | 0.63 | 0.63 |
3.9 | 0.31 | 0.32 | 0.31 | 0.32 | 0.32 |
|
Рис. 4. Калибровочный график(слева) зависимости отклика от концентрации н-пропанола в крови. Коэффициент корреляции составил 0.998. Калибровочный график(справа) зависимости отклика от концентрации н-пропанола в мышце. Коэффициент корреляции составил 0.998. |
Для количественной оценки содержания спиртов в образцах крови, а также отслежи-вания динамики их концентраций было взято 10 образцов трупной крови, изначально не содержавшей спирты группы С3-С5. Отслеживание новообразования проводилось в течение 4 недель.
|
Рис. 5. График зависимости концентраций н-пропанола и изо-бутанола от срока хранения in vitro в образце мышечной ткани №1 |
|
Рис. 6. График зависимости концентраций н-пропанола от срока хранения in vitro в образце мышечной ткани №2 |
|
Рис. 7. График зависимости концентраций н-пропанола и изо-бутанола от срока хранения in vitro в образце мышечной ткани №3 |
Рис. 8. График зависимости концентраций изо-бутанолаи изо-пентанола от срока хранения in vitro в образце крови №1 |
Рис. 9. График зависимости концентраций н-пропанолаи н-пентанола от срока хранения in vitro в образце крови №7 |
Где ссылки в тексте на рис. 5-9?!!!!
Для количественной оценки содержания спиртов в мышечной ткани было взято 3 образца, изначально не содержащих спирты С3-С5. Отслеживание новообразования проводилось в течение 4 недель.
В результате количественного обсчета проб биообъектов методом ГХ-МС нами были получены следующие данные: для наглядного отображения динамики изменения концентра-ций спиртов в исследуемых биообъектах были построены графические зависимости концент-раций соответствующих спиртов от срока хранения in vitro. Примеры графиков представлены на рисунках ниже.
При судебно-химическом исследовании тканей органов человека, хранящихся в холо-дильной камере различные периоды времени, были обнаружены следующие спирты: этанол, н-пропанол, изо-пропанол, бутанол-2, изо-бутанол, н-пентанол, изо-пентанол.
Заключение
Нами произведено исследование новообразования алифатических спиртов в биологи-ческом материале, результаты работы обосновывают судебно-химическое исследование био-материала для решения вопросов диагностики алкогольной интоксикации у живых лиц и трупов, а также обосновывают возможность обнаружения алифатических спиртов с течением времени при хранении образцов in vitro. Это имеет огромное значение в случае, когда перед экспертом ставится задача проведения повторной экспертизы.
При проведении судебно-химического исследования трупного материала, находящегося в состоянии гнилостной трансформации и интерпретации его результатовследует учитывать, что в результате жизнедеятельности целого ряда бактерий, принимающих участие в путрифи-кации трупов, происходит окисление аминокислот и жиров с образованием спиртов, в смеси которых содержатся метиловый, этиловый и высшие спирты. Под влиянием ферментов кишеч-ной палочки из глюкозы образуются различные количества пропилового, бутилового и мети-лового спиртов.
Это обстоятельство может существенно затруднять процесс обнаружения и количествен-ного определения спиртов при химико-токсикологическом анализе, а также быть причиной ошибочных заключений об их наличии в органах трупов.
Выводы
В ходе работы проведен анализ биоматериалов методом парофазной ГХ-МС, установ-лено:
При судебно-химическом исследовании тканей органов человека, хранящихся в холо-дильной камере различные периоды времени, были обнаружены следующие спирты: этанол, н-пропанол, изо-пропанол, бутанол-2, изо-бутанол, н-пентанол, изо-пентанол. Новообразование спиртов группы С2-С5 происходит в образцах, изначально не содер-жащих эти спирты. Выявлено, что подобранный метод для хроматографического разделе-ния этанола и изо-пропанола на колонке HP-FFAP не подходит; остальные спирты разде-ляются хорошо. Уровень концентрации спиртов может, как увеличиваться, так и умень-шаться. При проведении исследований эксперты должны учитывать возможность новооб-разования спиртов в пределах 0.5-1%.В образцах крови живых лиц новообразования спиртов не происходит потому, что в них добавляют антикоагулянты (гепарин, цитрат натрия). На основании проведенного анализа доказано отсутствие влияния гендерно-возрастных признаков.
Литература
Новиков алкогольной интоксикации на трупе. М.: Библиотека практического врача. 1967. 128с. , , К изучению механизма распределения этанола во внутренних органах при острой алкогольной интоксикации. Судебно-медицинская экспертиза отравлений. Сборник научных трудов. Л.: Сборник научных трудов. 1982. С.17-20. Зороастров острой смертельной алкогольной интоксикации при исследовании трупа. Тюмень: Издательство Тюменского государственного университета. 2003. 176с. К вопросу об относительном значении результатов определения этилового спирта в гнилостно измененном биологическом материале. Актуальные вопросы теории и практики судебной медицины. М. 1998. С.128-130 . , , О диагностике острых смертельных отравлений этанолом и возможности ее дальнейшего совершенствования. Судебно-медицинская экспертиза отравлений. Л.:Сборник научных трудов. 1982. С.14-17. , , Турсунов парофазного газохроматографического метода при исследовании ацетона в биологическом материале. М.: Наркология. 2015. №2. С.50-52.In the English version of this article, the Reference Object Identifier – ROI: jbc-02/16-46-6-11
The study of emergence of aliphatic alcohols group C1-C5
in the biological material and the study of the dynamics
of their concentrations in the postmortem period
© Kirill S. Dolgov,1 and Aleksandr V. Kirichek1, 2*+
1 Department of Expert Evaluation in Doping Control and Drug Control. Russian University of Chemical Technology Name after D. I. Mendeleev. Geroev Panfilovtsev St., 20. Moscow, 125480. Russia.
Phone: +7 (495) 495-24-26. E-mail: *****@***com
2 Department of Forensic Chemical Examination. State-owned Federal State Institution 111th Main Federal Center of Medical and Forensic Examination of the Ministry of Defense of the Russian Federation.
Gospitalnaya pl., 3. Moscow, 105229. Russia. Phone: +7 (499) 263-57-98. E-mail: *****@***ru
___________________________________
*Supervising author; +Corresponding author
Keywords: alcohols, emergence of alcohols, toxicology of alcohols, endogenous alcohol, the alcohols in biological objects by headspace gas chromatography method, the dynamics of the concentrations.
Abstract
Today the criteria of alcohol intoxication in the examination of living persons is developed in sufficient detail. In the method of examination at autopsy, there is a number of differences and there are still many issues that need to be resolved, among them – the distribution of alcohol in the body, assessment and treatment of forensic chemical analysis results, depending on the time of death and the changes over time of ethanol concentration in isolated cadaveric material. Each year, studies are in the field. But to date over methanol and alcohols C3-C5 group such studies have been conducted. The article describes a study of emergence of aliphatic alcohols – methanol, and a C3-C5 group in blood and muscle.
