Занятие 2
Тема: Простые и сложные методы окраски. Окраска по Граму. Структура бактериальной клетки. Принципы методов выявления капсул, жгутиков, спор.
1. Простые и сложные методы окраски микробов
Наиболее часто для изучения бактерий применяют микроскопирование препаратов, приготовленных из исследуемого инфицированного материала. Для этого препараты высушивают, фиксируют и окрашивают специальными красителями. Для приготовления фиксированного и окрашенного препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1-1,5 см. Если исследуют жидкий материал, то его непосредственно петлей наносят на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе.
Для фиксации используют физические и химические методы. Для фиксации мазка физическим методом предметное стекло медленно проводят 3 раза через пламя горелки. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей фиксируют химическим методом путем погружения их на 5-20 минут в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова и другие фиксирующие жидкости.
Для окрашивания микробов используют простые и сложные методы. При простом методе фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например, раствором фуксина (1-2 минуты) или метиленовым синим (3-5 минут), промывают водой, высушивают и микроскопируют. Сложные методы окрашивания включают использование нескольких красителей. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других. Наибольшее распространение получил метод окраски по Граму.
Окраска по Граму:
1. На фиксированный мазок помещают полоску фильтровальной бумаги и наносят раствор генцианового фиолетового. Через 2-3 минуты бумагу снимают, а остатки красителя сливают.
2. На препарат наносят раствор Люголя на 1-2 минуты.
3. На препарат наносят этиловый спирт на 30-60 секунд.
4. Препарат промывают водой.
5. Мазок докрашивают раствором фуксина в течение 1-2 минут.
6. Препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный цвет.
При окраске по методу Грама в модификации Синева на первом этапе используют заранее приготовленные полоски фильтровальной бумаги, пропитанные генциановым фиолетовым и высушенные. На фиксированный мазок помещают приготовленную бумажку, наливают небольшое количество воды и выдерживают в течение 2 минут. После этого бумажку удаляют пинцетом, сливают остатки красителя и наносят раствор Люголя. Последующее окрашивание проводят описанным способом.
Распределение микроорганизмов в зависимости от окраски по Граму:
1. Грамположительные бактерии:
- кокки (за исключением нейссерий - гонококков и менингококков);
- бациллы и клостридии (спорообразующие палочки);
- микобактерии, коринебактерии и листерии.
2. Грамотрицательные бактерии:
- некоторые кокки (нейссерии - гонококки и менингококки);
- остальные палочковидные бактерии;
- извитые формы (спириллы, спирохеты).
2. Структура бактериальной клетки
Структурные компоненты бактериальной клетки подразделяются на 2 вида:
- основные структуры (клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана с ее производными, цитоплазма с рибосомами и включениями, нуклеоид);
- временные структуры (капсула, жгутики, ворсинки, эндоспоры).
Клеточная стенка находится с внешней стороны от цитоплазматической мембраны. Функции клеточной стенки:
- защита бактерий от осмотического шока и других повреждающих факторов;
- определение формы бактерий;
- участие в метаболизме бактерий;
- токсичность за счет наличия поверхностных антигенов (у некоторых патогенных бактерий);
- наличие рецепторов для бактериофагов (у части бактерий).
Все бактерии в зависимости от окраски по Грамму подразделяют на 2 группы: грамположительные и грамотрицательные бактерии.
Клеточная стенка грамположительных бактерий состоит из одного толстого слоя пептидогликана, пронизанного молекулами тейхоевых кислот. Пептидогликан – это многослойный полимер, в котором чередуются остатки N-ацетилмурамовой кислоты и N-ацетилглюкозамина. У грамположительных бактерий содержание пептидогликана составляет от 50 до 90%. Слои пептидогликана связаны (прошиты) между собой тейхоевой и липотейхоевой кислотами. Клеточная стенка грамположительных бактерий плотно прилегает к цитоплазматической мембране, ее толщина составляет 20-100 нм.
Грамположительные бактерии прочно фиксируют комплекс генцианвиолета и йода, не обесцвечиваются этанолом и поэтому не воспринимают дополнительный краситель фуксин, в результате чего клетка остается окрашенной в фиолетовый цвет.
Клеточная стенка грамотрицательных бактерий состоит из 2-х тонких слоев. Внутренний слой образован тонким слоем пептидогликана. Пептидогликан располагается в периплазматическом пространстве. У грамотрицательных бактерий содержание пептидогликана составляет 1-10%. Наружный слой (внешняя мембрана) состоит из липополисахарида, белков и фосфолипидов. Толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий составляет 14-17 нм. Липополисахарид грамотрицательных бактерий обладает токсическими свойствами и называется эндотоксином. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий неплотно прилегает к цитоплазматической мембране.
У грамотрицательных бактерий комплекс генцианвиолета с йодом легко вымывается из клетки этанолом, и после дополнительного нанесения фуксина клетка окрашивается в красный цвет.
Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) и ее производные. Цитоплазматическая мембрана - это полупроницаемая липопротеиновая структура бактериальной клетки, отделяющая цитоплазму от клеточной стенки. Она составляет 8-15% сухой массы клетки. Ее разрушение приводит к гибели клетки. При электронной микроскопии выявлено ее трехслойное строение. Цитоплазматическая мембрана представляет собой комплекс белков и липидов. Основная масса липидов представлена фосфолипидами.
ЦПМ бактерий выполняет следующие функции:
- барьерная функция;
- избирательный перенос различных органических и неорганических молекул и ионов с помощью специальных переносчиков – транслоказ или пермеаз;
- превращение клеточной энергии;
- репликация и последующее разделение хромосомы.
В процессе роста клетки цитоплазматическая мембрана образует многочисленные впячивания (инвагинаты), получившие название мезосом.
Цитоплазма - это содержимое бактериальной клетки, ограниченное цитоплазматической мембраной. Она состоит из цитозоля и структурных элементов.
Цитозоль – это гомогенная фракция, включающая РНК, ферменты, продукты метаболизма.
К структурным элементам цитоплазмы относятся рибосомы, включения и нуклеоид.
Рибосомы – это органоиды, которые представляют собой гранулы диаметром 15-20 нм. Одна бактериальная клетка содержит от 5000 до 50000 рибосом. Рибосомы являются местом синтеза белка.
Включения – это образования, представляющие запасные вещества клетки. Из полисахаридов в клетках откладываются гликоген, крахмал и крахмалоподобное вещество - гранулеза. Полифосфаты содержатся в гранулах, называемых зернами волютина.
Нуклеоид является аналогом ядра. Он состоит из одной замкнутой в кольцо двуспиральной нити ДНК, которую называют бактериальной хромосомой. В отличие от истинного ядра эукариотических клеток у нуклеоида отсутствует ядерная оболочка. Кроме нуклеоида в бактериальной клетке могут присутствовать внехромосомные генетические элементы – плазмиды, которые представляют собой небольшие кольцевые молекулы ДНК, способные к автономной репликации. Роль плазмид состоит в том, что они кодируют дополнительные признаки, дающие клетке преимущества в определенных условиях существования. Наиболее распространены плазмиды, детерминирующие признаки антибиотикорезистентности бактерий (R-плазмиды).
Временные структуры образуются у некоторых бактериальных клетках или формируются в определенных условиях существования. К ним относятся капсула, жгутики, пили, эндоспоры бактерий.
Капсула - это слизистый слой на поверхности клеточной стенки бактерий. Функции капсулы:
- место локализации капсульных антигенов;
- защита клеток от фагоцитоза, механических повреждений и высыхания;
- адгезия - способность прикрепления клеток к субстрату.
Жгутики – это органы движения бактерий. Жгутики не являются жизненно важными структурами, поэтому могут присутствовать у бактерий или отсутствовать в зависимости от условий выращивания. По количеству и расположению жгутиков выделяют следующие группы бактерий:
- монотрихи – бактерии с одним полярно расположенным жгутиком;
- амфитрихи – бактерии с двумя полярно расположенными жгутиками или имеющие по пучку жгутиков на обоих концах;
- лофотрихи – бактерии, имеющие пучок жгутиков на одном конце клетки;
- перитрихи – бактерии со множеством жгутиков, расположенных по бокам клетки или на всей ее поверхности.
Химический состав жгутиков представлен белком флагеллином.
Ворсинки (пили). Эти структуры участвуют в адсорбции клеток на субстрате (пили общего типа) или в процессах переноса генетического материала (половые пили). Они образованы специфическим белком пилином.
У некоторых бактерий образуются эндоспоры, которые способствуют выживанию клеток в течение длительного времени в неблагоприятных условиях. Они устойчивы к неблагоприятным факторам внешней среды.
Расположение спор в клетке:
- центральное (возбудитель сибирской язвы);
- субтерминальное - ближе к концу (возбудитель ботулизма);
- терминальное – на конце палочки (возбудитель столбняка).
3. Принципы методов выявления капсул, жгутиков, спор
Капсула бактерий не воспринимает красителей. Для выявления капсулы применяют методы, позволяющие окрасить фон препарата и тело бактериальной клетки. Выявление капсулы по методу Бурри-Гинса:
1. На предметное стекло наносят каплю туши, а рядом – каплю исследуемого материала. Обе капли тщательно осторожно перемешивают и с помощью шлифованного стекла готовят мазок.
2. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют на пламени горелки.
3. Мазок окрашивают фуксином в разведении 1:3 или сафранином. При этом бактерии окрашиваются в красный цвет, капсулы остаются неокрашенными и выделяются на черно-коричневом фоне препарата.
Для выявления жгутиков готовят мазок и окрашивают его по Леффлеру:
1. Взвесь бактерий наносят в виде капли на предметное стекло и высушивают, не распределяя каплю по стеклу.
2. Обрабатывают препарат 15-20 минут протравой (смесь раствора фуксина с танином и сернокислым железом).
3. Тщательно промывают водой и высушивают на воздухе.
4. Докрашивают фуксином Циля в течение 3-4 минут при легком подогревании.
5. Промывают водой, высушивают, микроскопируют.
Споры бактерий с трудом воспринимают красители, поэтому применяют методы, позволяющие “разрыхлить” споровые оболочки и проникнуть красителю в глубокие слои. Окраска спор по методу Ожешки:
1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают на пламени горелки в течение 2-3 минут.
2. Кислоту сливают, препарат промывают водой, просушивают и фиксируют над пламенем горелки.
3. Окрашивают препарат по Цилю-Нильсену. Споры бактерий при этом приобретают красный цвет, а вегетативные формы – синий.
Литература для подготовки к занятию:
1. Борисов микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002.
2. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. . М., 2004.
3 Поздеев микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.
