Реакция гемопоэза на физическое воздействие и биологическая роль интерлейкина – 1 (экспериментальное исследование) ,

реакция гемопоэза на физическое воздействие

и биологическая роль интерлейкина – 1

(экспериментальное исследование)

,

Введение. В настоящее время известно, что одним из следствий воздействия радиационного фактора на организм является риск канцерогенеза. Излучение может вызвать рак в почти любой ткани или любом органе, хотя некоторые участки тела более подвержены индукции, чем другие [7]. Уже при малых дозах радиация может воздействовать как мутационный инициатор онкогенеза. Наиболее радиочувствительными по сравнению с другими типами клеток являются костномозговые предшественники [1, 2].  Даже малые дозы ионизирующего излучения усиливают апоптоз этих клеток. Исследователи предполагают  связь между индукцией цитокинов и процессами апоптоза. Так при облучении периферической крови в эксперименте и в группе ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС было выявлено увеличение числа клеток, синтезирующих ИЛ-4, ИЛ-6 и снижение числа клеток, синтезирующих ИЛ -1в [5].

Установлено, что пострадиационное восстановление гемопоэтических клеток костного мозга определяется процессами пролиферации и дифференцировки малоповрежденных или неповрежденных клеток – предшественниц. Регуляцию системы гемопоэза определяют гемопоэтические ростовые факторы. В последние годы в ряде исследований был продемонстрирован радиозащитный эффект гемопоэтических ростовых факторов, в частности таких рекомбинантных цитокинов, как интерлейкин - 1 (ИЛ-1), ИЛ-2, ИЛ-3, гранулоцитарно - макрофагального колониестимулирующего фактора (КСФ-ГМ). Предполагают, что радиозащитное действие цитокинов связано с индукцией белков острой фазы за счет перехвата радикалов и некоторой активации пострадиационного восстановления гемопоэза и гормональной активности [4, 8, 15]. Существенную роль в радиозащитном эффекте клеток миелоидного ряда и лимфоидных предшественников играет ИЛ-1, действуя путем активации стромы костного мозга. ИЛ-1 является мультифункциональным медиатором. Иммунный и гемопоэтический спектр активности ИЛ-1 определяется усилением комитогенной пролиферации, индукцией экспрессии рецептора к ИЛ-2, увеличением синтеза и продукции ИЛ-4, 5, 6, активацией функции естественных киллеров (NK). При действии ИЛ-1 преактивированные В-клетки обнаруживают усиление пролиферации, у макрофагов активируется фагоцитоз, синтез различных радикалов и фактор некроза опухоли –б (TNF - б), повышается уровень молекул MCH II класса [6, 10, 12, 13]. Важно отметить, что ИЛ-1 по своим биологическим эффектам близок к ИЛ-6 и TNF – б и тандем этих цитокинов действует неразрывно в процессах иммунной регуляции и апоптоза [6, 11, 14]. Учитывая огромную биологическую и защитную роль системы ИЛ-1, снижение при облучении количества клеток,  синтезирующих этот цитокин, для изучения пострадиационного восстановления гемопоэза в эксперименте был выбран ИЛ-1, как медиатор гемопоэтической активности. Целью настоящего исследования явилось изучение реакции гемопоэза на различные физические воздействия (ионизирующее излучение, температура) и биологической роли ИЛ-1.

Материалы и методы исследования.  В работе использовали  48 крыс - самцов линии Вистар массой 170-220 грамм. Эксперимент включал 3 этапа.

I этап -  16 крыс в течение 36 дней получали 25 сеансов общего R-облучения по 2 R/сутки или 0, 5 мКл/кг на сеанс, из них 8 животных дополнительно подвержены нагреванию при температуре 37,5о С 4 часа в сутки. Изолированному воздействию тепла в таком же режиме подвергались ещё 8 животных. 

24 крысы составили контрольные группы.

II этап - через 6 месяцев после проведения I этапа вводили человеческий ИЛ-1 (Dainippon) в суточной дозе 500 ЕД/кг массы тела внутрибрюшинно (всего 5 инъекций) 8 крысам опытной группы и 8 крысам одной из контрольных серий. Оставшимся 8 животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно физиологический раствор (0,85%)  NaCl с такой же периодичностью и дозой, как и ИЛ – 1.

III этап -  через 2 недели после последней инъекции ИЛ-1 или физиологического раствора крыс забивали для морфологических и физико-химических исследований клеток крови и костного мозга.

Забой животных  контрольных и опытных групп проводили одновременно через 6 месяцев от начала радиационного воздействия. 

В работе использовано  6 групп животных.

I группа - контрольная группа животных без физического и фармакологического воздействия для сравнения морфологического состояния костного мозга (n= 8). 

II группа – крысы, подвергшиеся воздействию R-облучения  (n=8).

III группа – крысы, подвергшиеся воздействию тепла (n=8).

IV группа – крысы, подвергшиеся сочетанному воздействию R-облучения и тепла (n=8).

V группа – крысы, получившие на фоне сочетанного действия R-облучения и температуры инъекции ИЛ-1 (n=8).

VI группа – крысы контрольной группы, получившие инъекции ИЛ-1 (n= 8).

VII группа - крысы контрольной группы, получившие инъекции физиологического раствора (n= 8).

Источником костного мозга служили бедренные кости. Суспензию костно-мозговых клеток готовили механическим способом в среде, для чего суспензию пропускали через шприц с последовательно убывающими иглами, фильтровали через 4-хслойный капроновый фильтр. Костный мозг окрашивали гематоксилин-эозином, подсчитывали  ядросодержащие клетки. Данные обрабатывали статистически. Экспериментальные исследования на животных выполнялись в институте физиологии НАН Беларуси (директор академик НАН Беларуси , зав. лабораторией д. б.н., профессор ). Забор и лабораторная обработка костного мозга, морфо – цитологический анализ проводился  лично авторами.

Результаты и обсуждение. Преобладающее число экспериментальных работ касается воздействия какого – либо одного экзогенного фактора, тогда как в реальной жизни на живой организм одновременно действует их множество. Коллективом сотрудников Института физиологии НАН Беларуси установлены значительные изменения функционирования эндокринной и иммунной систем, энергообеспечения тканей, достоверное снижение массы тела и угнетение поведенческих реакций животных, подвергшихся сочетанному воздействию ионизирующего излучения и тепла [4, 9]. В связи с этим проведено изучение отдаленных гемопоэтических эффектов R-облучения, а так же сочетанного действия облучения и температуры. Показатели морфологического состава костного мозга крыс отражены в таблице 1. Как видно, в группе животных, получивших облучение в суммарной дозе 50 R, через 6 месяцев отмечено достоверное снижение количества мегакариоцитов (МГКЦ) по отношению к контролю и тенденция к увеличению общей клеточности (p<0,1). Остальные показатели морфологического состава костного мозга не претерпели достоверных изменений. В группе животных, подвергшихся сочетанному воздействию радиации и температуры, установлено достоверное увеличение по отношению к контролю  количества бластов и снижение общей клеточности, количества МГКЦ и клеток эритроидного ряда. Костный мозг опытной группы животных, подвергшихся воздействию только температуры, не имел достоверных различий по отношению к контролю ни по одному параметру. Установлено снижение количества миелокариоцитов (МЛКЦ) и угнетение эритроидного ростка в группе крыс, подвергшихся сочетанному воздействию облучения и температуры, по отношению к животным, получившим только сеансы облучения (p<0,05). Кроме того снижение числа МГКЦ сочеталось с нарушениями в их структуре, характеризующимся наличием анизоцитоза этих клеток  (появление микро - и  в большей степени и макроформ МГКЦ в костном мозге, детерминацией их ядра). Имеется нарушение созревания клеток красного ростка, о чем свидетельствует достоверное  уменьшение зрелых и  созревающих клеток (полихрохроматофильных и оксифильныхе нормоцитов, проэритробластов и базофильных нормоцитов). Фактор деления красного ростка  (ФДКР) - митотический индекс клеток эритроидного ряда – снижен, что говорит о нарушении процессов пролиферации. Несмотря на отсутствие количественных изменений нейтрофильного ростка через 6 месяцев после воздействия радиации и температуры следует отметить, что морфологический анализ миелоидного ростка показал достоверное снижение зрелых нейтрофильных гранулоцитов по сравнению с молодыми и созревающими клетками этого ряда. Это свидетельствует, что процессы пролиферации клеток миелоидного ряда после воздействия физических факторов (ионизирующее облучение и температура) проходят интенсивно, но с нарушением (замедлением) процессов дифференцировки нейтрофилов.

Таблица 1

Морфологический состав костного мозга крыс, подвергшихся

различным физическим воздействиям

Показатели костного мозга	Группы животных
I	II	III	IV
МЛКЦ, ·109/л	371,0 ± 20,1	486,2 ± 20,2	414,0 ± 24,5	140,9 ± 26,8 * **
МГКЦ, ·109/л	0,14 ± 0,03	0,070 ± 0,002 *	0,19 ± 0,07	0,063 ± 0,001*
бласты, %	1,8 ± 0,4	2,6 ± 0,3	2,0 ± 0,3	3,0 ± 1,4 *
нейтрофильный росток, %	33,6 ± 3,1	30,8 ± 2,4	31,3 ± 3,0	33,5 ± 4,5
лимфоциты, %	17,9 ± 1,6	16,3 ± 2,0	16,0 ± 1,4	16,0 ± 4,0
моноциты, %	2,6 ± 0,6	3,1 ± 0,5	3,8 ± 0,3	4,5 ± 0,5
эритроидный росток, %	27,3 ± 2,4	31,5 ± 2,0	29,5 ± 1,9	14,4 ± 2,2 * **

Примечание: *  - достоверность различий по отношению к контролю;  ** - достоверность различий между II и IVгруппами животных. 

Таким образом, наиболее выраженные изменения морфологического состава  костного мозга отмечены в группе животных, подвергшихся сочетанному воздействию малых доз радиации и температуры, и характеризуются снижением количества МЛКЦ, МГКЦ, повышением количества бластных клеток и угнетением эритроидного ростка. Количественные изменения морфологического состава костного мозга сопровождались нарушением процессов дифференцировки всех гемопоэтических ростков с преобладанием молодых форм.

С целью коррекции выявленных нарушений животным опытной группы, в которой были обнаружены наиболее выраженные изменения морфологического состава костного мозга (IV группа), вводили рекомбинантный ИЛ-1 (V группа). Результаты исследования клеточного состава костного мозга после сочетанного воздействия физических факторов и введения ИЛ-1 представлены в табл. 2.

Таблица 2

Показатели морфологического состава костного мозга крыс,

подвергшихся  различным воздействиям

Показатели костного мозга	Группы животных
I	IV	V	VI	VII
МЛКЦ, ·109/л	371,0 ± 20,1	140,9 ± 26,8	187,0 ± 24,0	429,0 ± 16,0	360,0 ± 22,0
МГКЦ, ·109/л	0,140 ± 0,03	0,063 ± 0,001	0,098± 0,008 Р1	0,170± 0,035	0,121± 0,013
бласты, %	1,8 ± 0,4	3,0 ± 1,4	2,2 ± 0,3	1,7 ± 1,2	2,3 ± 0,8
нейтрофильный росток, %	33,6 ± 3,1	33,5 ± 4,5	35,2 ± 4,4	35,4 ± 6,5	35,2 ± 4,0
лимфоциты, %	17,9 ± 1,6	16,0 ± 4,0	28,6 ± 3,6 Р1	19,3 ± 3,9	15,0 ± 2,8
моноциты, %	2,6 ± 0,6	4,5 ± 0,5	2,8 ± 0,6	2,8 ± 0,1	2,3 ± 0,2
эозинофильный росток, %	10,0 ± 3,2	9,2 ± 2,9	16,0 ± 2,2 Р1	14,9 ± 3,8	12,0 ± 2,0
эритроидный росток, %	27,3 ± 2,4	14,7 ± 2,2	14,3 ± 1,9	24,6 ± 2,3	29,5 ± 2,1

Примечание: Р1 - достоверность различий анализируемых показателей между IV и Vгруппами;  P2 - достоверность различий анализируемых показателей между V и VI группами; Р3 - достоверность различий анализируемых показателей между I и VI группами; Р4 - достоверность различий анализируемых показателей между VI и VII группами.

На фоне введения цитокина в группе животных, подвергшихся сочетанному воздействию радиации и температуры, обнаружено достоверное увеличение количества МГКЦ, лимфоцитов и клеток эозинофильного ростка. Стимулирующий эффект рекомбинантного ИЛ-1 подтверждается сопоставлением данных животных I и VI, а так же VI и VII групп.  Достоверных различий между относительными показателями клеточного состава костного мозга в этих группах не отмечено, но при сопоставлении контрольных групп выявлена тенденция к повышению активности всех гемопоэтических линий у животных, получавших инъекции ИЛ-1, что подтверждает стимулирующее действие цитокина на клетки костного мозга.  В то же время уровень и качество восстановления костного мозга определяется степенью зрелости клеток. Несмотря на одинаковую общую клеточность в I, VI и VII группах, имеются выраженные отличия в качественном морфологическом составе. Так, в VI группе обнаружено достоверное увеличение числа зрелых нейтрофилов (палочкоядерных и сегментоядерных элементов) по отношению к аналогичным показателям в I и VII группе животных, что свидетельствует в пользу усиления процессов дифференцировки клеток миелоидного ростка кроветворения под влиянием ИЛ-1.

Анализ показателей эритроидного ростка костного мозга выявил у IV группы животных, получивших малые дозы радиации и тепла, угнетение общего количества всех эритроидных клеток и нарушение созревания клеток красного ростка (табл.1, табл. 3). Так, в IV экспериментальной группе отмечено достоверное снижение по отношению  к контролю общего количества клеток эритроидного ряда, а так же оксифильных и полихроматофильных нормоцитов на фоне повышения количества незрелых форм – эритробластов и проэритробластов, что обуславливает низкий фактор деления красного ростка (ФДКР). При сравнении показателей V и VI групп не уставновлено достоверных различий ни по одному анализируемому параметру (табл. 3). Под действием ИЛ-1 на фоне радиации и тепла не происходит активации эритропоэза и индекс созревания эритробластов остается низкий, из чего можно сделать вывод, что ИЛ-1 самостоятельно не участвует в процессе пролиферации и созревания клеток эритроидного ростка. Полученные результаты не противоречат известным литературным данным об отсутствии стимулирущего влияния данного цитокина на эритропоэз [10, 11, 13]. Наличие достоверных различий между показателями V и VI связано не с повышенным стимулирующим действием ИЛ-1 на эритроидный росток здорового костного мозга, а  изначальной разницей в показателях контрольной группы и группы животных, подвергшихся сочетанному воздействию радиации и температуры. Это подтверждается отсутствием достоверных различий между показателями VI и VII групп.

Таблица 3

Показатели эритропоэза в костном мозге крыс, подвергшихся  различным воздействиям

Показатели	Группы животных
I	IV	V	VI	VII
Общее количество, %	27,3 ± 2,4	14,7 ± 2,2 Р1	14,3 ± 2,0 P2	24,6 ± 2,3 P3	29,5 ± 2,1
Эритробласты, %	0,50 ± 0,06	2,0 ± 0,15 Р1	1,35 ± 0,12 P2	0,7 ± 0,17	1,18 ± 0,15
Проэритробласты, %	0,70 ± 0,04	1,5 ± 0,09 Р1	1,1± 0,11	0,8 ± 0,12	0,9 ± 0,1
Базофильные нормоциты, %	7,25 ± 0,9	4,8 ± 0,2	4, 8 ± 0,2	5,3 ± 1,2	8,5 ± 1,6
Полихроматофильные нор-моциты, %	10,3 ± 2,0	4,9 ± 0,3 Р1	5,3 ± 0,3 P2	9,0 ± 1,3 P3	10,9 ± 0,7
Оксифильные нормоциты, %	8,5 ± 1,2	1,5 ± 0,1 Р1	1,8 ± 0,09	8,8 ± 0,2 P3	8,1 ± 0,2
ФДКР	0,58 ± 0,03	0,31 ± 0,01 Р1	0,4 ± 0,012 P2	0,64 ± 0,012 P3	0,53 ± 0,017

Примечание: Р1 - достоверность различий анализируемых показателей между I и IVгруппами;  P2 - достоверность различий анализируемых показателей между I и V группами;  P3 - достоверность различий анализируемых показателей между V и VI группами.

Выводы. Таким образом, у животных, подвергшихся комбинированному действию малых доз радиации  и тепла, через 6 месяцев выявлены нарушения процессов кроветворения, характеризующиеся снижением общей клеточности и МГКЦ, повышением количества бластных клеток и угнетением эритроидного ростка. Особый интерес представляют качественные пострадиационные изменения гемопоэза, проявляющиеся замедлением процессов дифференцировки всех гемопоэтических ростков с преобладанием молодых форм. Под влиянием интерлейкина – 1, введенного через 6 месяцев после сочетанного воздействия радиации и температуры, установлена тенденция к увеличению общей клеточности, достоверное повышение количества МГКЦ, лимфоцитов и клеток эозинофильного ростка, а так же усиления процессов дифференцировки клеток миелоидного ростка кроветворения. В процессе пролиферации и созревания клеток эритроидного ростка ИЛ-1 не участвует.

Summary. At the animals, small dozes of radiation undergone to combined influence and heat, in 6 months infringements of hematopoietic processes are revealed: decrease general bone marrow cellularity and megakaryocyts, increase of quantity blasts and oppression erythropoesis. Qualitative postradiating modifications of hemopoiesis were showed by delay of processes of a differentiation of all hematopoietic lineages with prevalence of young forms. Under influence interleukin - 1 the tendency to increase general cellularity, authentic increase of quantity megakaryocyts, lymphocyts and cells eosinophylic lines, and as amplification of processes of a differentiation of myeloid cells is established. In proliferation process and maturing of cells erythroid lines interleukin – 1 does not participate. 

Литература:

, , //Фундаментальные и прикладные аспекты радиобиологии: биологические эффекты малых доз и радиоактивное загрязнение среды: Тезисы докладов международной конференции. – Мн., 1998. – с. 8. , , и др. // Международный журнал радиационнй медицины. – 2001. – т. 3, № 1 – 2. – с. 155. , , // Фундаментальные и прикладные аспекты радиобиологии: биологические эффекты малых доз и радиоактивное загрязнение среды: Тезисы докладов международной конференции. – Мн., 1998. – с. 39. , // Радиационная биология. радиоэкология. – 1996. – Т. 36, вып. 3. – с. 338 – 434. , , // Сб. мат. 2-ой международной конференции «Отдаленные медицинские последствия Чернобыльской катастрофы». – Киев, 1998. – с. 246. , , и др.// Иммунология. – 2001. - № 1. – с. 6- 10. Отчет научного комитета по действию атомной радиации генеральной Ассамблее ООН.// Медицинская радиология и радиационная медицина. – 2001. - № 1, том 46. – с. 28 – 47. // Сб. трудов «Медицинскиеаспекты влияния малых доз радиации на организм детей и подростков». – 1991. – вып. 2. – с. 26- 31. // Экологическая антропология. – 1998. -  с. 285 – 287. Dinarello Ch. G. // Cytokine and Growth Factor. – 1997. – vol.8. – P. 253 – 265. Dinarello C. A. // Eur Cytokine Netw. – 1994. - vol. 5. – P. 517 – 531. Hoshino T., Winkler – Picketl R. T., Mason A. T. et al. // Ibid. – 1999. – vol. 162, № 1. – P. 51 – 59. Loppnow H. // Internist. – 2001. – vol. 42. – P. 13 – 27. Loppnow H., Werdan K., Reuter G. et al. // Eur Cytokine Netw. – 1998. - vol. 9. – P. 670 – a R., Oppenheim J. J., Douches S. D.// J. Immunol. – 1988. – Vol. 140, № 1. – P. 108 – 111.