Гигиена, токсикология, санитария (стр. 1 )

Государственное

санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации

ПРОЕКТ

ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

медико-биологическАЯ оценкА безопасности наноматериалов

Методические указания

МУ 1.2.  -10

Москва

2010

ББК

Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов. 2010. – 123 с.

1. Авторский коллектив:

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ()

Учреждение Российской академии медицинских наук научно-исследовательский институт питания РАМН (, , , , )

Федеральное государственное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия (, , ).

Учреждение Российской академии медицинских наук научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Почетного академика РАМН (, , ,  , , )

Государственное учебно-научное учреждение Биологический факультет Московского государственного университета имени (, , )

Учреждение Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН (, , )

Учреждение Российской Академии наук Институт биохимии им. РАН (, , ).

Федеральное государственное унитарное предприятие «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологической службы» (ФГУП ВНИИМС) (., )

(, ).

2. Рекомендованы Государственной Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации

«_____» _________________2010 г.

4. Введены в действие «_______» ______________________2010 г.

5. Введены впервые.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ        6

I. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ        7

II. НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ        8

III. ВВЕДЕНИЕ        10

IV. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ        11

V. Медико-биологическое тестирование безопасности наноматериалов на культурах клеток высших животных        17

5.1. Требования к используемым культурам клеток        17

5.2. Схема введения наноматериалов животным и сроки наблюдения        17

5.3. Подготовка аэрозольно обработанных наноматериалами животных        17

5.4. Приборы и оборудование        18

5.5. Материалы и реактивы        19

5.6. Приготовление  растворов и сред        22

5.7. Получение и культивирование клеточных культур        24

5.7.1. Получение первичных клеточных культур        24

5.7.2. Ведение и подготовка перевиваемых клеточных культур к тестированию        26

5.8. Проведение тестирования безопасности наноматериалов in vitro с использованием клеточных культур        27

5.8.1. Подготовка клеточных культур и образцов наноматериалов к тестированию и внесение образца наноматериала в культуру        27

5.8.2. Ход тестирования        28

5.9. Оценка цитотоксических свойств наноматериалов.        28

5.9.1. Оценка цитотоксичности с помощью МТТ        28

5.9.2. Оценка цитотоксичности путем определения активности лактатдегидрогеназы        30

5.9.3. Оценка цитотоксичности путем определения концентрации АТФ в лейкоцитах        31

5.9.4. Оценка влияния наноматериалов на функциональную активность макрофагов        33

5.9.5. Определение активности ферментов, участвующих в “респираторном взрыве”        36

5.9.6. Оценка влияния наноматериалов на ФМА-индуцированную дифференцировку моноцитарных клеточных культур в макрофаги        38

5.9.7. Оценка влияния наноматериалов на продукцию макрофагами фактора некроза опухоли-альфа        39

5.10. Оценка иммунотропного действия наноматериалов        42

5.10.1. Оценка влияния наноматериалов на поликлональную активацию лимфоцитов в реакции бласттрансформации лимфоцитов        42

5.10.2. Оценка влияния наноматериалов на продукцию лимфоцитами интерферона-гамма (ИНФ-γ) методом ИФА        43

5.11. Оценка безопасности наноматериалов методом проточной цитофлюориметрии по качественным и количественным изменениям в клетках высших животных        45

5.11.1. Определение содержания Т - и В-лимфоцитов и соотношения Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов        46

5.11.2. Выявление маркера ранней активации лимфоцитов        47

5.11.3. Оценка апоптотической и пролиферативной активности лейкоцитов        49

5.11.4. Оценка цитотоксического действия наноматериалов на лейкоциты периферической крови человека        50

5.11.5. Определение цитолитической активности лимфоцитов        51

5.11.6.Оценка фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов животных        53

VI. Оценка безопасности наноматериалов с использованием в качестве тест-объекта семян высших растений        55

6.1. Принцип биотестирования на проростках высших растений        55

6.2. Оборудование, материалы, реактивы        55

6.3. Характеристика тест-систем        56

6.4. Условия тестирования        56

6.5. Подготовка к проведению тестов        57

6.5.1. Подготовка посуды для биотестирования        57

6.5.2. Подготовка субстрата для проращивания семян высших растений        57

6.5.3. Приготовление исследуемых проб наноматериалов        58

6.5.4. Подготовка семян        58

6.6. Процедура биотестирования        58

6.7. Оценка  и интерпретация результатов биотестирования        59

VII. Оценка безопасности наноматериалов с использованием
интегральных тестов на лабораторных животных        60

7.1. Предварительные замечания        60

7.2. Методики измерения легочной функции        61

7.2.1. Методика измерения легочной функции in vivo – электроплетизмография        61

7.3. Методики измерения функций сердечно-сосудистой системы        65

7.3.1. Тестирование безопасности наноматериалов на  инвазивной модели тромбогенеза        65

7.3.2. Методика электроплетизмографического измерения артериального давления в хвостовой артерии        68

7.3.3. Методика регистрации АД с использованием имплантируемых катетеров        72

7.3.4. Методика регистрации ЭКГ у бодрствующих крыс в покое и при стрессирующем
воздействии        88

7.4. Тестирование безопасности наноматериалов на основе определения гематологических показателей лабораторных животных        95

7.4.1. Определение кинетики агрегации и дезагрегации эритроцитов        95

7.4.2. Оценка деформационных свойств эритроцитов и вязкости крови        99

7.5. Оценка безопасности наноматериалов по интегральным показателям  системы
детоксикации ксенобиотиков        102

7.5.1. Метод гексеналовой пробы        102

7.5.2. Метод пробы с бромсульфалеином        104

7.6. Оценка безопасности наноматериалов по интенсивности местных воспалительных
реакций        106

7.6.1. Методика накожных аппликаций        106

7.6.2. Методика конъюнктивальная проба        109

7.7. Тестирование безопасности наноматериалов по поведенческим реакциям животных        110

7.7.1. Методика теста «открытое поле»        110

7.7.2. Методика теста «приподнятый крестообразный лабиринт»        114

7.7.3. Методика условного рефлекса пассивного избегания        117

7.8. Тестирование безопасности наноматериалов на основе определения физической выносливости животных        119

7.8.1. Метод истощающего плавания        119

7.8.2. Методика динамометрического измерения произвольной силы скелетных мышц передних конечностей        121

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

МТТ	3-(4,5-диметитиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид
НСТ	нитросиний тетразолий
КонА	конконавалин А
ЛПС	липополисахарид
ОФД	ортофенилендиамин
ФМА	форболмиристилацетат
ФИТЦ	1-флуоресцеинизотиоцианат
ОФД	ортофенилендиамин
ФМА	форболмиристилацетат
FCS	Фетальная сыворотка телёнка
DMEM	Сухая среда Игла в модификации Дульбекко
ДТТ	дитиотреитол
ФГА	фитогемагглютинин
фикоэритрин	PE
ЧБР	Чувствительность кардиохронотропного  барорецепторного рефлекса
УРПИ	Условный рефлекс пассивного избегания
ВЭЖХ	высокоэффективная жидкостная хроматография
СОП	стандартные операционные процедуры
НРБ	нормы радиационной безопасности
ИФА	иммуноферментны анализ
ИФН	интерферон
БСФ	бромсульфофталеин
МУ	методические указания
ДМСО	диметилсульфоксид
ДСН	додецилсульфат натрия
Трис	трис-оксиметиленаминометан
HEPES	N-2-гидроксиэтилпиперазин-N`-2-этансульфоновая  кислота
ЭДТА	этилендиаминтетраацетат
ППС	полная питательная среда
ФСБ	фосфатно-солевой буфер
ЛДГ	лактатдегидрогеназа
ФЭ	фенилэфрин
НП	нитропруссид
CPM	(число) импульсов в минуту
ФНО	фактор некроза опухолей
КЭ	клетки-эффекторы
КМ	клетки-мишени
LG50	50%-ная летальная концентрация
АД	артериальное давление
АЦП	аналогово-цифровой преобразователь
ЧСС	частота сердечных сокращений
ЭКГ	электрокардиограмма
ПИ	пульсовый интервал
ЧБР	чувствительность кардиохронотропного  барорецепторного рефлекса

I. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

1.1. Настоящие методические указания устанавливают требования к медико-биологической оценке безопасности наночастиц и наноматериалов искусственного происхождения на основе тестов на культурах клеток, семенах высших растений и лабораторных животных