Тема занятия 44: Лабораторная диагностика гонореи

Тема занятия 44: Лабораторная диагностика гонореи.

Цель занятия: знакомство с методами лабораторной диагностики гонококковой инфекции.

Перечень знаний и практических навыков

Охарактеризовать возбудителя гонореи. Знать классификацию гонореи. Изучить патогенез гонококковой инфекции. Уметь проводить забор биологического материала для исследования на гонорею. Проводить дифференциальную диагностику гонореи бактериоскопическим методом. Овладеть методами бактериологической диагностики гонореи.

Эпидемиология

Заболеваемость гонореей является одной из актуальных медико-социальных проблем, что обусловлено ее широким распространением, серьезными осложнениями и не всегда эффективным лечением. В России уровень числа регистрируемых больных гонореей увеличился с 105,6 на 100 тыс населения в 1989 г. до 139,0 в 1996 г. Однако, по сравнению с 1993 г., в 1996 г. число зарегистрированных больных гонореей уменьшилось на 40,2%.

Снижение уровня заболеваемости гонореей, по всей видимости, происходит из-за неполной регистрации больных различными структурами, которые занимаются оказанием медицинской помощи населению, но не контролируются органами и учреждениями здравоохранения (частнопрактикующие врачи, медицинские кооперативы, совместные предприятия, медицинские работники разных специальностей, а также лица, вообще не имеющие медицинского образования). Важным фактором, влияющим на неполный учет больных, является самолечение, которому способствует свободная продажа антибактериальных лекарственных препаратов. Все перечисленные факты, обусловившие кажущееся снижение уровня заболеваемости гонорейной инфекцией, являются потенциально опасными, так как в дальнейшем они же могут привести к ее резкому подъему.

Классификация гонореи

В настоящее время принята классификация гонореи, изложенная в Международной статистической классификации болезней Х пересмотра 1999 г.

A54.0 Гонококковая инфекция нижних отделов мочеполовых путей без абсцедирования периуретральных или придаточных желёз.

A54.1 Гонококковая инфекция нижних отделов мочеполовых путей с абсцедированием периуретральных и придаточных желёз. A54.2+ Гонококковый пельвиоперитонит и другая гонококковая инфекция мочеполовых органов. A54.3 Гонококковая инфекция глаз. A54.4+ Гонококковая инфекция костномышечной системы. A54.5 Гонококковый фарингит. A54.6 Гонококковая инфекция аноректальной области. A54.8 Другие гонококковые инфекции. A54.9 Гонококковая инфекция неуточнённая.

Эта классификация близка к таковой, изложенной в методических материалах «Диагностика, лечение и профилактика ЗПП» (1997).

Гонорея нижних отделов мочеполовых путей без осложнений. Гонорея нижних отделов мочеполовых путей с осложнениями. Гонорея верхних отделов мочеполовых путей и органов малого таза. Гонорея других органов.

Далее указывают полный топический диагноз.

К гонорее нижних отделов мочеполовых путей относят поражение уретры, парауретральных желёз, желёз преддверия влагалища, слизистой цервикального канала, влагалища; к гонорее верхних отделов мочеполовых путей (восходящей) – поражение матки, придатков и брюшины.

Предлагают также классификацию (1993), в основу которой положены длительность и выраженность клинических проявлений заболевания. Различают:

свежую (с длительностью заболевания до 2 мес), которую подразделяют на острую, подострую и торпидную (малосимптомную или асимптомную со скудным экссудатом, в котором обнаруживают гонококков); хроническую (продолжительностью более 2 мес или с неустановленной давностью заболевания). Хроническая гонорея может протекать с обострениями.

Возможно гонококконосительство, (возбудитель не вызывает появление экссудата и отсутствуют субъективные расстройства).

Возбудитель

Гонококки (N. gonorrhoeae) впервые описаны А. Нейссером в 1879 г.

Гонококки имеют бобовидную форму, располагаются в виде диплококков, окружены микрокапсулой, жгутиков не имеют, спор не образуют, аналогично менингоккам. В клеточной стенке имеется наружная мембрана, белки которой подразделяют на три группы по их функциональному значению. Для гонококков характерно наличие пилей, которые отличаются друг от друга по своим антигенным свойствам (16 антигенных вариантов). С помощью пилей они закрепляются на поверхности эпителиальных клеток, сперматозоидов, эритроцитов. Гонококки культивируют на питательных средах, содержащих нативный белок (сыворотка крови, асцитическая жидкость). Лучше растут при содержании 3-5% СО2. На асцитагаре образуют прозрачные колонии с ровными краями. Из углеводов ферментируют только глюкозу, образуют каталазу и цитохромоксидазу - типичные для нейссерий ферменты.

Гонококк грамотрицательный, расположен внутриклеточно (в цитоплазме лейкоцитов). Гонококки высокочувствительны к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды: погибают при температуре выше 55 °С, высыхании, обработке растворами антисептиков, под влиянием прямых солнечных лучей. Гонококк сохраняет жизнеспособность в свежем гное до высыхания. Основной путь заражения – половой (от инфицированного партнёра). Контагиозность инфекции для женщин составляет 50–70%, для мужчин – 25-50%. Гораздо реже гонорея передаётся бытовым путём (через грязное бельё, полотенца, мочалки), в основном у девочек. Возможность внутриутробного инфицирования не доказана.

Снаружи гонококки покрыты капсулоподобной субстанцией, затрудняющей их переваривание. Персистенция инфекции возможна внутри лейкоцитов, трихомонад, эпителиальных клеток (незавершённый фагоцитоз), что осложняет лечение.

При неадекватном лечении могут образовываться L-формы гонококков, отличающиеся по своим морфологическим и биологическим характеристикам от типичных форм. L-формы – шаровидные, имеют различную величину и окраску. Они нечувствительны к препаратам, вызвавшим их образование, антителам и комплементу за счёт утраты части своих антигенных свойств. Персистенция L-форм затрудняет диагностику и лечение заболевания и способствует выживанию инфекции в организме в результате реверсии в вегетативные формы. В связи с широким использованием антибиотиков возникло большое количество штаммов гонококка, вырабатывающих фермент в-лактамазу и, соответственно, устойчивых к действию антибиотиков, содержащих в-лактамное кольцо.

Антигены

Антигенная структура гонококков изменчива. Это связано с наличием многочисленных антигенных вариантов пилей, которые формируются в процессе развития инфекции.

Экспрессия некоторых антигенов гонококка определяется условиями окружающей среды. Это связано с тем, что основную антигенную нагрузку несут пили и поверхностные белки клеточной стенки, распознаваемые иммунокомпетентными клетками. Изменение антигенной структуры снижает эффективность иммунных реакций. Различают фазовые вариации (проявляются изменением или прекращением образования некоторых антигенных детерминант) и антигенные вариации (проявляются изменением структуры распознаваемых Аг за счёт включения новых детерминант).

N. gonorrhoeae отличают уникальные генетические характеристики. У этих бактерий довольно легко происходит трансформация вида; в отличие от большинства бактерий, этот процесс может происходить на протяжении периода жизни одной популяции. Кроме того, доказана возможность передачи генетической информации посредством конъюгации. У большинства штаммов N. gonorrhoeae имеется латентная плазмида. Её роль или связь с функциями клетки неизвестна. У некоторых штаммов обнаружены F - и R-плазмиды, стимулирующие конъюгацию бактерий. Также выделена плазмида, несущая ген бета-лактамазы. Её утрата приводит к потере устойчивости к пенициллину. Характерной особенностью гонококков считают способность к трансформации в любой период ростового цикла; подобным свойством обладают все выделенные штаммы N. gonorrhoeae. Частота генетических трансформаций в колониях типов Р+ и Р++ в 1000 раз выше, чем в колониях типа Р-.

Патогенность и патогенез

Гонококки поражают преимущественно отделы мочеполовых путей, выстланные цилиндрическим эпителием, – слизистую оболочку цервикального канала, маточных труб, уретры, парауретральные и большие вестибулярные железы. При генитальнооральных контактах могут развиваться гонорейный фарингит, тонзиллит и стоматит, при генитальноанальных – гонорейный проктит. При попадании возбудителя инфекции на слизистую оболочку глаз, в том числе и при прохождении плода через инфицированные родовые пути, появляются признаки гонорейного конъюнктивита.

Стенка влагалища, покрытая многослойным плоским эпителием, устойчива к гонококковой инфекции. Однако в некоторых случаях (при беременности, у девочек и у женщин в постменопаузе), когда эпителий истончается или становится рыхлым, возможно развитие гонорейного вагинита. Характерной особенностью гонококков является их способность проникать в лейкоциты и размножаться в них. Липоолигосахаридная часть клеточной стенки оказывает токсическое действие. Капсулярные полисахариды подавляют фагоцитоз. Соединяясь с ворсинками цилиндрического эпителия слизистой уретры, а у женщин и эндоцервикального канала, гонококки проникают внутрь клеток при участии белков наружной мембраны клеточной стенки. Это приводит к развитию острого уретрита, цервицита и поражению у женщин шейки матки, придатков (трубы, яичники), у мужчин семенных пузырьков, предстательной железы.

Гонококки, попадая в организм, быстро фиксируются на поверхности эпителиальных клеток при помощи пилей, а затем проникают вглубь клеток, межклеточные щели и подэпителиальное пространство, вызывая деструкцию эпителия и развитие воспалительной реакции.

Гонорейная инфекция в организме чаще всего распространяется по протяжению (каналикулярно) из нижних отделов мочеполовых путей в верхние. Более быстрому продвижению нередко способствуют адгезия гонококка к поверхности сперматозоидов и энтеробиоз внутри трихомонад.

Иногда гонококки попадают в кровяное русло (обычно они гибнут под действием бактерицидной активности сыворотки), приводя к генерализации инфекции и появлению экстрагенитальных очагов поражения, среди которых чаще всего встречают поражения суставов. Реже развивается гонорейный эндокардит и менингит.

В ответ на внедрение возбудителя гонореи в организме вырабатываются антитела, но иммунитет при этом неэффективен. Человек может заражаться и болеть гонореей многократно. Это можно объяснить антигенной вариабельностью гонококка.

Иммунитет

При гонорее имеет место гуморальный иммунный ответ. Однако образующиеся антибактериальные антитела не обладают протективными свойствами. В течение заболевания образуются IgA, подавляющие прикрепление пилей возбудителя к клеткам слизистой уретры. Однако они не способны защитить слизистую от последующего заражения другими генерациями гонококков, что связано с изменением их антигенной структуры. Это приводит к реинфекциям и рецидивам, а также к переходу заболевания в хроническую форму.

Гонококковые инфекции

Возбудитель гонореи и бленнореи N. gonorrhoeae (по предварительной классификации гонококк) принадлежит к семейству Neisseriaceae, рода Neisseria. В мазках из выделений больных гонококки имеют форму кофейных зерен, грамотрицательные, располагаются парами как внутри лейкоцитов (незавершенный фагоцитоз), так и вне клеток. По своим морфологическим признакам они очень похожи на менингококков. Для гонококков присущ полиморфизм – встречаются мелкие и крупные клетки, редко палочковидной формы. К питательным средам очень прихотливы. Лучше растут на средах, содержащих кровь, сыворотку, асцитическую жидкость. Гонококки содержат протеиновые и полисахаридные антигены, по которым разделены на 16 сероваров, но в рутинных баклабораториях их пока не определяют. Для микробиологической диагностики гонококковых инфекций используют бактериоскопический, бактериологический, серологический и аллергический методы.

Взятие материала для исследования

Чтобы достойно и доброкачественно провести бактериологическую и бактериоскопическую диагностику, важно правильно взять клинический материал. Его, как правило, должен проводить врач. У мужчин исследуют выделения мочеиспускательного канала, парауретральных ходов, прямой кишки, при показаниях – материал из ротоглотки, а также секрет предстательной железы после ее массажа. Можно также исследовать осадок и "нити" мочи, но в них гонококки выявляются значительно реже. Перед взятием материала из уретры больной должен не мочиться в течение 4-5 ч, не употреблять антимикробные препараты и дезинфицирующие растворы. Наружное отверстие уретры сначала протирают стерильным ватным тампоном, смоченным 0,85% раствором хлорида натрия, затем сухим тампоном. Мазки изготавливают из материала, взятого путем соскоба со слизистой уретры бактериологической петлей или специальной ложечкой Фолькмана. При незначительных выделениях необходимо сделать предварительный массаж уретры. У женщин материал берут из уретры, парауретральных ходов, шейки матки, прямой кишки, а по показаниям – и из ротоглотки. Сначала очищают влагалище от выделений, проводят массаж уретры и путем соскоба бактериологической петлей или ложечкой Фолькмана забирают материал. Шейку матки сначала протирают стерильным ватным тампоном для удаления слизистой пробки. Выделения из канала шейки матки берут бактериологической петлей или пинцетом. Материал из дистального отдела прямой кишки берут с помощью ложечки Фолькмана слепым методом, т. е. без какой-либо подготовки больного, или с помощью ректоскопа или ректального зеркала. В этом случае изучаемый материал забирают непосредственно из видимого места поражения. При орофарингеальной гонорее слизь из ротоглотки берут стерильными ватными тампонами на специальных держателях из стальной проволоки. Для диагностики бленореи выделение конъюнктивы снимают бактериологической петлей. Редко гонорея осложняется гоносепсисом, эндокардитом, артритом. Тогда материалом для исследования служит кровь или синовиальная жидкость. Принимая во внимание высокую чувствительность гонококков к колебаниям температуры, исследуемые материалы доставляют в лабораторию в специальных термосах или сумках с грелкой.

Бактериоскопическое исследование

Бактериоскопическое исследование является наиболее распространенным, хотя и менее чувствительным методом лабораторной диагностики гонореи и бленнореи по сравнению с выделением чистых культур. Это особенно касается хронического течения болезни, когда в исследуемом материале содержится незначительное количество гонококков. Однако при правильном взятии материала, повторных обследованиях пациентов, применении методов провокации, квалифицированной оценке мазков, бактериоскопическое исследования достаточно часто дает возможность быстро и верно диагностировать заболевание. С исследуемого материала изготавливают два тонких равномерных препарата-мазка. Один окрашивают метиленовой синькой, второй – по методу Грама. При отсутствии метиленового синего можно окрашивать один мазок 1% водным раствором кристаллического фиолетового или 0,5% раствором бриллиантового зеленого течение 1 мин. Заключение о наличии гонококков делают, основываясь на таких их свойствах: грамотрицательная окраска, диплококковая структура, форма кофейных зерен, расположение внутри лейкоцитов. Под влиянием антибиотиков и других химиопрепаратов а также при хронической гонорее морфология и окраски гонококков могут меняться. Отдельные клетки приобретают различную форму и величину (так называемые формы Аша). Кроме того, в исследуемом материале могут находиться подобные гонококков грамотрицательные кокки из рода Veillonella. Это в некоторой степени ограничивает диагностическую ценность метода первичной микроскопии. Лучшие и надежные результаты дает метод иммунофлюоресценции. Тонкие мазки из выделений больных фиксируют в пламени горелки. На них наносят меченую изотиоцианатом флуоресцеина антигонококовую сыворотку на 1 час при 35°С во влажной камере. После этого мазки дважды промывают буферным раствором, наносят забуференный глицерин и покрывают покровной стеклами. При взаимодействии гонококков с мечеными антителами под люминесцентным микроскопом видно характерное свечение вокруг бактериальных клеток.

Бактериологическое исследование

Показаниями к выделению чистых культур гонококков неоднократные отрицательные результаты бактериоскопии, наличие подозрительных на гонококков, но не идентифицированных морфологически микроорганизмов, а также для достоверного установления излеченности заболевания. Очень важно немедленно поместить посевы в термостат. При невозможности проведения посевов на месте взятия материала можно поместить ватный тампон в пробирку с транспортной средой Стюарта, которое обеспечивает сохранение жизнеспособности гонококков во время доставки в лабораторию. Посевы проводят по стандартной схеме в одну из специальных питательных сред в пробирках или чашках Петри (КДС, Бейли, кровяной или сывороточный агар, сухие питательные среды Харьковского предприятия "Биолек" по производству бактериальных и лекарственных препаратов). Для диагностического культивирования гонококков во многих странах используют еще "шоколадный" агар. Наилучшими являются среды, изготовленные на основе агара из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец. Добавление к ним 20 ЕД/мл полимиксина и 2 мкг/мл линкомицина значительно повышает частоту высева гонококков, поскольку указанные препараты подавляют рост других бактерий. Все среды перед посевом подогревают в термостате в течение 15-20 мин. Чашки и пробирки с посевами помещают в эксикаторы, где создают атмосферу с 20% С02. Колонии, как правило, вырастают через 18-24 ч, однако возможен и поздний рост. Тогда посевы выдерживают в термостате (в эксикаторе!) До 8 суток, ежедневно проверяя появление роста. Колонии гонококков, выросшие имеют круглую, слегка выпуклую форму, ровные края, блестящую поверхность, слизистую консистенцию. Они прозрачны, как капельки росы, почти бесцветные, хотя могут случаться и беловатые варианты. Полученные колонии исследуют макро - и микроскопически. В мазках гонококки располагаются парно, тетрадами и скоплениями. Типичные колонии пересевают на скошенный сывороточный агар для выделения чистой культуры. Окончательную идентификацию проводят, учитывая морфологические, культаральные, ферментативные и антигенные свойства. Биохимически гонококки мало активны. На сывороточных средах с 1,5% различных углеводов они расщепляют только глюкозу, но не мальтозу и сахарозу. Оксидазную активность выделенных культур определяют путем нанесения на колонии (после микроскопии) 1% раствора диметилпарафенилендиамина. Оксидазопозитивные колонии сначала краснеют, а позже чернеют. Дифференциация гонококков от других видов рода Neisseria имеет особое значение при диагностике орофарингеальной гонореи. Как известно, на слизистой миндалин, рото - и носоглотки постоянно находится большое количество грамотрицательных нейссерий – представителей нормальной микрофлоры человека. Надежными методами идентификации гонококков являются реакции иммунофлюоресценции, латекс - и коаглютинации а также определения ферментативных свойств. Обязательно проводят качественное определение чувствительности или резистентности микроорганизмов к антибиотикам с помощью метода диффузии в агар с использованием дисков. С целью повышения частоты нахождения гонококков в мазках при первичной микроскопии и более надежного выделения чистых культур, особенно в случаях вялого, хронического течения заболевания прибегают к методам провокации гонореи, то есть искусственного обострения патологического процесса, в результате чего в выделениях появляется большее количество гонококков.

Основными из этих методов являются:

а) химический – введение в уретру 0,5% раствора нитрата серебра у мужчин, смазывание канала шейки матки 2-5% раствором нитрата серебра;

б) механическое – введение прямого бужа в уретру на 10 мин, или проведения передней уретроскопии;

в) биологический – внутримышечное введение гоновакцины в количестве 500 млн. микробных тел или пирогенала 200 МПД;

г) алиментарный – употребление соленой, острой пищи;

д) термический – прогревание половых органов индуктотермичним током;

е) физиологический – взятие мазков во время менструаций.

Еще лучше комбинировать несколько методов провокации, например, химический, алиментарный и биологический. В последнее время для более надежного выявления возбудителя гонореи применяют метод полимеразной цепной реакции. Она позволяет выявить возбудителя в случаях хронической гонореи, когда бактериоскопическое и бактериологическое исследование не дает положительных результатов.

Серологическая диагностика

Серологическую диагностику гонореи осуществляют сравнительно редко, в основном, при хроническом ее течении, когда бактериоскопическое и бактериологические исследования не дают положительных результатов. В современных условиях проводят иммуноферментный анализ, РНГА и реакции Борде-Жангу (РСК). Антигенами для этих реакций служат: убитая нагревом поливалентная гонококковая вакцина, вакцина, инактивированная ультразвуком, протеиновые и полисахаридные фракции гонококков, а также пиридиновый антиген. ИФА и РНГА является высокоспецифичным и достоверными серологическими реакциями. По сравнению с прошлым РСК несколько утратила свою роль. Она не имеет практического значения при диагностике острой гонореи, поскольку ее лечат еще до образования значительного количества антител. Для установления достоверности излечения она вообще непригодна. Реакция Борде-Жангу имеет важное значение при серодиагностики хронической гонореи, особенно при осложненных его формах (гоносепсис, метрит, артрит, простатит и др.). Диагностическое значение аллергических проб несколько обесценивается тем, что они положительные течение многих лет после перенесенной гонореи. Для их постановки внутрикожно вводят 0,1 мл свежей гонококковой вакцины (100 млн микробных клеток в 1 мл). Через 24 ч наблюдают гиперемию, иногда с отеком в центре.

Лечение и профилактика

Для терапии гонореи используют антибиотики: бета-лактамы (пенициллины, цефалоспорины) и другие антибиотики. Вакцинопрофилактика гонореи не проводится ввиду отсутствия эффективных вакцин. Для предупреждения бленнореи всем новорожденным закапывают на конъюнктиву глаза раствор одного из перечисленных антибиотиков.

ВОПРОСЫ ДЛЯ ОБСУЖДЕНИЯ

Эпидемиология гонореи. Классификация гонореи. Характеристика возбудителя гонококковой инфекции. Антигены гонококков. Патогенность и патогенез. Иммунитет при гонорее. Взятие материала для исследования. Бактериоскопическое исследование. Бактериологическое исследование. Серологическая диагностика гонореи.