Фармакокоррекция иммунотоксических эффектов аверсекта-2 при обработке животных в экспериментальных и производственных условиях (стр. 2 )

Реализация. Результаты научно-исследовательской работы внедрены в «Таврический» Таврического района Омской области и учебный процесс в ФГБОУ ВПО ОмГАУ имени .

Публикация результатов исследований.  По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе две из них – в журналах, рекомендованных ВАК. В совместных публикациях 80% материала принадлежит автору.

На защиту выносятся следующие положения:

Авермектинсодержащий препарат Аверсект-2 угнетает гемопоэз и снижает иммунную реактивность животных при однократном введении в терапевтических и токсических дозах. Энтеросорбция с использованием углеродного сорбента, модифицированного бетулином, нивелирует иммунотоксические эффекты Аверсекта-2.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на  150 страницах компьютерного текста и включает разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследования, заключение, выводы, практические рекомендации, приложение. Работа иллюстрирована 30 таблицами, 53 рисунками. Список литературы включает 145 источников, в том числе иностранных авторов - 35.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и методы исследования

Тема диссертации является разделом плановой научно-исследовательской работы Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Омский государственный аграрный университет имени » «Фармакотоксикологическая оценка новых лекарственных средств и пестицидов» с номером государственной регистрации 01201158552.

Эксперименты выполнены на базе кафедры диагностики, внутренних незаразных болезней, фармакологии, хирургии и акушерства ФГБОУ ВПО ОмГАУ имени и «Таврический» Таврического района Омской области в период с 2009 по 2012г. г. Дизайн исследований представлен на рисунке 1.

       В опытах использовали противопаразитарный препарат Аверсект-2 (1% раствор аверсектина С) производства Фармбиомед (Москва, Россия) и углеродный энтеросорбент, модифицированный бетулином в этанольно-глицериновой основе (ИППУ СО РАН, г. Омск).

       

Рисунок 1 – Дизайн исследований

       

В лабораторных экспериментах в качестве опытной модели использовали 196 белых беспородных лабораторных крыс  в возрасте 3-х и 6-ти месяцев с массой г и 260-290г соответственно, содержащихся в условиях вивария на стандартном рационе. В производственных условиях объектом исследования служил крупный рогатый скот черно-пестрой породы: двадцать коров в возрасте 4-5 лет и пятнадцать 9-ти месячных бычков. Все манипуляции с лабораторными животными осуществляли с соблюдением рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (2003).

Для определения влияния токсических доз Аверсекта-2 на поведение препарат вводили лабораторным крысам однократно, подкожно. Контрольными группами служили интактные животные. Животных всех групп подвергали ежедневно в течение 3-х суток после интоксикации неврологическому тестированию. Тестирование в установке «Открытое поле» проводили через 48 часов после затравки (Я. Буреш, О. Бурешова, 1991г.).

Для подсчета лейкоцитов, эритроцитов и лейкограммы использовали гематологический анализатор Sysmex XT(Япония) или счетную камеру Горяева, лейкограмму в этом случае определяли по мазкам крови, окрашенным по методу Романовского-Гимза. Для выявления фермента миелопероксидазы (МРО) и незрелых форм гранулоцитарного ростка мазки крови окрашивали по методу Грэхема-Кнолля (1966). Для более объективного суждения о содержании фермента использовали полуколичественный метод оценки L. Kaplowa (1955) в модификации G. Astaldi и L. Verga (1957) с вычислением среднего цитохимического коэффициента (К). НСТ-тест (спонтанный и активированный) проводили по методике Стьюарта в модификации Нагоева (1975), фагоцитарную активность лейкоцитов крови определяли по методу Гостева (1950).

Состояние клеточного звена иммунного ответа при введении в организм Аверсекта-2 определяли по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у лабораторных крыс по методике Lagrange et al. (1980). Гуморальный иммунный ответ у крыс на введение Аверсекта-2  в терапевтической дозе оценивали методом A. J.Cunningham (1965) по количеству антителообразующих клеток (АОК) на 4 и 8 сутки после проведения противопаразитарной обработки. В те же сроки устанавливали характер гуморальной иммунной реакции к Т-зависимому антигену. 

Материалом для изучения общей патоморфологической картины при интоксикации и обработке Аверсектом-2 служили органы иммунной системы крыс и бычков: тимус, селезенка, мезентериальные лимфатические узлы, а также печень.  Патматериал фиксировали в 4%-ном нейтральном растворе формальдегида и заливали в парафин (, 1967).  Из блоков готовили срезы толщиной 5 мкм. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином по методу Ван-Гизона.  Окрашенные препараты исследовали под световым микроскопом.

Статистическую обработку цифровых данных проводили  в программе STATISTICA6.1rus, при этом для оценки результатов производственного опыта использовали t-критерий Стьюдента для зависимых выборок. Результаты лабораторных опытов оценивали по непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна-Уитни для независимых выборок. При этом вычисляли медиану (Me), а границы варьирования изучаемой совокупности показателей определяли в пределах  от нижнего  до верхнего  квартилей (P25 ; P75). Дополнительно определяли среднее арифметическое значение (M)  и отклонение от среднего арифметического значения (m).

Структура поведения лабораторных крыс при острой интоксикации Аверсектом-2

Крысам опытных групп  Аверсект-2 вводили однократно подкожно в дозах 2, 20 и 40 мг/кг. Контролем  служили интактные животные. Тестирование в установке «Открытое поле» проводили через 48 часов после затравки. Изменения поведения крыс всех опытных групп были однотипными. Токсические дозы Аверсекта-2 вызывали достоверное снижение показателей «числа пересеченных линий» и увеличение «количества циклов неподвижности», а также времени «реакции замирания». Интоксикация приводила к угасанию активных форм поведения и преобладанию пассивных поведенческих актов у крыс  в условиях новой обстановки.

Гематологические показатели и неспецифическая резистентность  крыс  при острой интоксикации Аверсектом-2

После интоксикации Аверсектом-2 в дозе 2 мг/кг количество лейкоцитов, процентное содержание палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов снижаются по сравнению с группой контроля. Через 4 суток в периферической крови появляются незрелые формы гранулоцитов – метамиелоциты. Абсолютное содержание различных форм лейкоцитов в периферической крови крыс представлено на рисунке 2.

Острая интоксикация Аверсектом-2 в дозах 20 и 40 мг/кг сопровождается развитием лейкопении в первые сутки после введения препарата,  через 40 суток снижается процентное и абсолютное содержание сегментоядерных нейтрофилов и моноцитов.

При проведении морфологического анализа лейкоцитов через 14 суток после введения Аверсекта-2 у всех опытных крыс наблюдались в разной степени выраженные однотипные изменения: присутствие в периферической крови промиелоцитов, метамиелоцитов и лимфоцитов с вакуолизированной цитоплазмой. В сегментоядерных нейтрофилах у животных опытных групп регистрировали токсическую зернистость цитоплазмы и фрагментацию ядер.

Рисунок 2 - Абсолютное содержание лейкоцитов в крови  крыс (n=5) через 4 (А) и 14 (Б) суток после интоксикации Аверсектом-2 в дозе 2 мг/кг относительно контроля (100%). 

Примечание : достоверность различий относительно контроля * - р≤0,05.

Изменения со стороны показателей эритроцитарного ростка кроветворения отмечали через 7 и 14 суток после введения Аверсекта-2 в дозе 2 мг/кг. Количество эритроцитов снизилось на 22,7% (р≤0,01) и  20% (р≤0,05) соответственно. При этом уровень гемоглобина в крови опытных крыс статистически достоверно не отличался от контроля.  При интоксикации в дозах 20 и 40 мг/кг  регистрировали снижение количества эритроцитов и гемоглобина уже через 1 сутки после затравки на 43 и 46% и 37 и 34% соответственно. В дальнейшем количество эритроцитов у животных, интоксицированных в дозе 20 мг/кг, постепенно возрастало и через 14 суток достигло прежнего уровня, однако при исследовании крови через  30 и 40 суток вновь отмечали снижение содержания эритроцитов и гемоглобина. В группе с более высокой дозой Аверсекта-2 (40 мг/кг) уровень эритроцитов в периферической крови был достоверно ниже, чем у интактных животных, на всем протяжении исследования. 

При однократной интоксикации крыс Аверсектом-2 в дозе 20 мг/кг достоверное увеличение среднего цитохимического коэффициента миелопероксидазы отмечено через 14 суток после введения препарата. Эта тенденция сохраняется и через 30 суток с момента интоксикации у крыс, получивших препарат в дозах  20 и  40 мг/кг.

Патоморфологические  изменения в органах иммунной системы крыс при острой интоксикации Аверсектом-2

Морфологическое исследование проводили через 14 и 40 суток после острой интоксикации крыс Аверсектом-2 в дозах 2; 20 и 40 мг/кг.

У крыс, получивших препарат в дозе 2 мг/кг массы тела, при  вскрытии отмечали застойную гиперемию тимуса и селезенки. Тимус сохранял типичное строение. Корковое вещество каждой дольки содержит большое количество лимфоцитов, плотно прокрашено, а мозговое вещество окрашено в бледно-розовый цвет и демонстрирует менее плотное содержание. При гистоисследовании селезенки были установлены следующие морфологические различия между группами интоксицированных и интактных крыс. При  визуальной оценке диаметры лимфатических фолликулов белой пульпы у опытных крыс больше, чем у контрольных, шире и  маргинальная зона. При анализе гистосрезов мезентериальных лимфатических узлов крыс опытной группы установлено сужение границ коркового вещества с уменьшением количества и размеров лимфатических фолликулов. Граница паракортикальной зоны стерта, в мозговом веществе лимфатических узлов клетки располагаются менее плотно, чем у интактных крыс. Внешний вид печени макроскопически не изменен. При микроскопическом исследовании регистрировали появление многочисленных лейкоцитарных инфильтратов в паренхиме органа, зернистую дистрофию гепатоцитов и развитие простого сливающегося мелкоочагового некроза.