Актуальность исследований клеточного цикла в современной биологии. Понятие клеточного цикла. Морфологические маркеры цикла, биохимические. Периоды цикла и их длительность. Способы измерения длительности цикла и отдельных периодов.
Клеточные культуры как объект изучения клеточного цикла. Методы синхронизации клеток в культуре: селекционная, индукционная, естественная. Гетерокарионы. Эксперименты по слиянию клеток млекопитающих в разных периодах цикла. Явления доминировния митоза, ареста клеточного цикла, точек контроля и обратной связи. Разнообразие клеточных циклов и вариантов деления.
Деления созревания ооцитов и дробление у амфибий. Прогестероновая стимуляция созревания. Эксперименты с микроинъекцией цитоплазмы ооцитов. Изменение активности MPF в течение клеточного цикла. Биохимическая модель клеточного осциллятора. Идентификация циклина.
Продуктивность использования генетического подхода. Необходимость нового объекта. Дрожжи Saccaromyces cerevisia, Schizosaccharomices pombe, жизненные и клеточные циклы. Сdc мутации, их взаимодействие. Роль циклина B, протеинкиназы Cdc2, фосфатазы Cdc25 и протеинкиназы Wee1.
Доказательства универсальности MPF. Разнообразие циклинов и циклин зависимых киназ, их роль. Исследования свойств MPF в бесклеточном экстракте.
Деление клетки. Функции MPF в митозе и цитокинезе и связанные с ними структурные изменения клетки. Переход метафаза-анафаза. Структура и функции APC, убиквитинизация или специфическое фосфорилирование, разрушение белков в протеасоме. Роль сепаразы. Морфология митоза: конденсация и движение хромосом. Динамика цитоскелета микротрубочек в клеточном цикле. Микротрубочковые моторы. Хромосомные белки: центромерные, когезины, конденсины, шугошин. Комплекс белков-пассажиров, Аврора-киназа, Polo-киназа. Различия митоза у дрожжей и многоклеточных.
Длительность G1 и переход к S-периоду у одноклеточных (дрожжей) и многоклеточных. Особенности циклов ранних делений (деления дробления). Белок Rb. Варианты ретинобластомы у человека. Супрессоры опухолей.
Репликация хромосом и ее организация. Сборка и активация ORC. Предотвращение повторной репликации у дрожжей. Ткани, имеющие измененную плоидность, их значение для организма. Особенности клеточных циклов, приводящие к изменению плоидности. Эндоциклы: полиплоидия, политения. Амплификация. Эндомитоз.
Точки контроля клеточного цикла. Параметры состояния клетки, которые контролируются в разные фазы цикла. Условные мутации, нарушающие точки контроля перехода G2-M и M-A у дрожжей.
Компоненты точек контроля: сенсоры, связь с регуляторами цикла, исправление повреждений, обратная связь. Роль белка p53 в точках контроля. Контроль повреждения ДНК, атаксия-телангиэктазия у человека, ATM, ATR. Контроль прикрепления хромосом к веретену. Роль белков-пассажиров.
Особенности мейотических циклов. Синаптонемный комплекс, мейотические варианты хромосомных белков. Структура бивалента и особенности кинетохора. Особенности точек контроля в мейозе. Точка контроля синапсиса хромосом.
Надклеточная регуляция цикла. Сигнальные пути, стимулирующие пролиферацию, рост и выживание. Сигнальный путь Ras, МАР-киназы, путь PI 3-киназы. Сигнальные пути TGF-в и ингибирования апоптоза. Сигнальный путь при нетипичном воздействии прогестерона на ооцит.
Роль клеточного матрикса в регуляции деления клеток. Феномен латерального ингибирования. Киназа фокальной адгезии и Src - киназа. Протоонкогены и онкогены, тумор - супрессоры. Апоптоз.
Методы селекции мутаций, связанных с клеточным циклом. Подходы к изучению летальных мутаций: поздние летали, клоны соматических клеток, способы получения. Методы визуализации белков: иммуноокрашивание, флуоресцентные протеины (FP). Микроскопия, позволяющая визуализировать клеточные структуры in vivo. Методы изучения белок-белковых взаимодействий: FRET, дрожжевая дигибридная система.
Раздел 2. Генетика развития
Тема 1. Организация эукариотического генома.
Введение в предмет. Общие понятия: типы развития – мозаичный и регуляционный, тотипотентность яйца и плюрипотентность эмбрионального генома в раннем развитии, детерминация как элемент эмбриональной дифференцировки, морфогенез и его составляющие - гистогенез и органогенез, метаморфоз и рост.
Феногенетика. Задачи генетики развития: время и место действия гена. Методы: анализ мутантов, мозаики, материнские эффекты, анализ экспрессии генов на уровне транскрипции и трансляции; манипуляции с генами и эмбрионами, генетическая модификация генома как инструмент анализа функций генов эукариотического генома.
Основные типы ДНК и компоненты генома: повторы и гены, теломеры и центромеры, мобильные генетические элементы. Функциональная классификация генов и роль разных категорий генов в фенотипическом разнообразии дифференцированных клеток.
Сколько генов и какая доля генома контролирует развитие. Структурные изменения ДНК в ходе развития и клеточной дифференцировки: перестройки генов, диминуция хроматина, элиминация хромосом.
Дифференциальная активность генов – современная парадигма развития. Роль эпигенетической модификации генома в развитии и дифференцировке.
Тема 2. Развитие дрозофилы.
Овогенез и становление позиционной информации в яйце. Оплодотворение.
Характеристика стадий развития: ранний и поздний эмбриогенез, личиночные стадии развития, куколочная стадия развития, имаго. Тотипотентность яйца и детерминация клеточной бластодермы. Феномен митотической регионализации бластодермы. Гинандроморфы и мозаики как инструмент изучения детерминации. Имагинальные диски и феномен компартментализации.
Трансдетерминация.
Тема 3. Гены развития.
Классификация генов развития: гены материнского эффекта, гены сегментации и гомеозисные гены.
Роль материнских генов в становлении передне-задней и дорзально-вентральной осей эмбриона и позиционной информации. Значение экспрессии генов сегментации группы “gap” в прочтении позиционной информации, созданной материнскими генами. Молекулярная сегментация синтициальной бластодермы под контролем генов сегментации группы pair-rule. Парасегменты и становление их границ под контролем генов wingless, engrailed, fushi-tarazu и др.
Тема 4. Гомеозисные гены комплексов ANT-C и BX-C, их структура и организация.
Иерархическая регуляция и взаимодействие генов комплексов ANT-C и BX-C; анализ компаундов и трансгенных мух. Эволюционный консерватизм гомеозисных генов и кластерной их организации. Роль гомеозисных генов в становлении осевых координат в развитии млекопитающих.
Тема 5. Ранее развитие мыши и экспрессия генов в развитии мыши.
Ранее развитие мыши как пример регуляционного типа развития.
Организация яйца и оплодотворение. Деления-дробления, первые признаки эмбриональной дифференцировки – компактизация и кавитация. Формирование бластоцисты и первичных экто – и энтодермы и трофэктодермы. Обособление клеток внутренней массы и выделение зачатка первичных половых клеток. Имплантация, гаструляция и образование мезодермы.
Тотипотентность в раннем развитии, формирование химер. Асинхронность дифференцировки и обратимость утраты плюрипотенции. Асинхронность утраты потенций в развитии млекопитающих, стволовые клетки тканей взрослого животного как источник регенерации.
Геномное деметилирование ДНК в мужском и женском пронуклеусах, активное и пассивное деметилирование, метилирование de novo.
Активность генома в первых делениях дробления до стадии бластоцисты.
«Пучковая» (координированная) активация генов. Микрочиповая технология оценки активности эмбрионального генома на разных стадиях развития. Транс-мембранные сигнальные системы регуляции в развитии млекопитающих.
Эволюционный консерватизм этих систем на примере млекопитающих и дрозофилы.
Дифференциальная активность генов.
Тема 6. Трансгенез животных. Эмбриональные стволовые клетки.
Технологии манипулирования с генами, хромосомами и эмбрионами.
Методы получения трансгенных животных с помощью микроинъекций рекомбинантных ДНК в пронуклеус зигот. Механизмы интеграции чужеродной ДНК, идентификация трансгенных животных, трансген как облигатный компонент генома трансгенных животных, особенности наследования трансгенов при интеграции их на одно-, двух - и четырех клеточной стадиях развития, мозаичность трансгенных животных.
Копийность трансгенов и «эффект положения», эктомическая и мозаичная экспрессии трансгенов. Инсерционный мутагенез (интеграция трансгена) и его последствия. Техника поиска функциональных сайтов в промоторах с использованием генов репортеров.
Особенности трансгенеза у дрозофилы с использованием Р-элементов. Микроинъкции рекомбинантных ДНК в полярную зону ранних эмбрионов дрозофилы. Организация Р-элементов и использование их концевых повторов в конструировании векторов. Идентификация трансгенных мух.
Технология трансгенеза в исследованиях проблем развития.
Технология получения эмбриональных стволовых (ЭС) клеток из клеток внутренней массы бластоцист млекопитающих, их культивирование и оценка их плюрипотентности и тотипотентности. Комбинирование ЭС клеток с эмбрионами и получение химерных животных и потомства с генотипом ЭС клеток. ЭС клетки как вектор для создания трансгенных животных.
Тема 7. Технология «генной мишени» и «нокаута генов».
Технология «генной мишени» и «нокаута генов». Гомологичная рекомбинация между экзогенной ДНК (рекомбинантной) и гомологичным сайтом в хромосоме, способы выявления направленной инсерции трансгена в ген-мишень при трансформации ЭС клеток с помощью электропорации. Введение трансформированных ЭС клеток в полость бластоцисты для генерирования химерных мышей с дальнейшим получением от них потомства с «нокаутными» генами, оценка функции гена в развитии через получение направленных мутаций («нокаута») в гене-мишене.
Создание линий мышей с желаемыми хромосомными перестройками (делециями, транслокациями, дупликациями) с использованием технологи Cre-LoxP-site. Направленное ввведение сайтов для рекомбиназы фагов в геном ЭС клеток посредством гомологичной рекомбинации и дальнейшей их транзиторной трансформации плазмидой с прокариотической рекомбиназой.
Тема 8. Импринтинг млекопитающих.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 |
