Функциональные характеристики эндотелиальных клеток в условиях in vitro в присутствии факторов, секретируемых плацентой при физиологической беременности и беременности, осложненной гестозом (стр. 2 )

Впервые выявлен повышенный уровень трансэндотелиальной миграции моноцитов в присутствии факторов, секретируемых плацентой при гестозе, сопровождающийся повышенной экспрессией CD11b моноцитами и молекулы CD119 (рецептора IFNг) эндотелиальными клетками, что указывает на участие этих молекул в развитии воспаления в плаценте при гестозе. Факторы, секретируемые плацентой при гестозе, снижают количество и миграционную активность эндотелиальных клеток линии EA. hy926, что может являться механизмом нарушения ангиогенеза в плаценте in vivo и индукции системной эндотелиальной дисфункции вследствие изменения секреторной активности клеток иммунной системы.

Предложен метод оценки биологической активности фармацевтических препаратов, предназначенных для коррекции эндотелиальной дисфункции, по определению их влияния на изменение количества эндотелиальных клеток.

Основные положения, выносимые на защиту:

Факторы, секретируемые клетками плацент женщин в первом триместре физиологической беременности, изменяют фенотип эндотелиальных клеток линии EA. hy926, стимулируют экспрессию СD11а и трансэндотелиальную миграцию моноцитоподобных клеток линии ТНР-1, усиливают миграционную активность эндотелиальных клеток и способствуют увеличению их количества. В условиях in vivo подобное влияние факторов, секретируемых клетками плаценты, на эндотелиальные клетки способно обеспечить физиологическое развитие сосудистого русла плаценты, в том числе за счет привлечения в децидуальную оболочку и плаценту моноцитов\макрофагов, контролирующих процессы ангиогенеза и инвазии трофобласта. Факторы, секретируемые плацентой женщин в третьем триместре физиологической беременности, снижают интенсивность трансэндотелиальной миграции моноцитоподобных клеток линии THP-1, а также экспрессию адгезионных молекул CD62P и CD54 эндотелиальными клетками линии EA. hy926 и экспрессию CD11a моноцитоподобными клетками линии ТНР-1. Подобное изменение фенотипа и функциональной активности эндотелиальных клеток плаценты и децидуальной оболочки под влиянием секреторных продуктов плаценты может способствовать физиологической стабилизации сосудистого русла плаценты и снижению миграции мононуклеаров периферической крови в децидуальную оболочку и плаценту к концу беременности. В третьем триместре беременности сниженная продукция плацентой как проангиогенных, так и антиангиогенных факторов, определяет сниженную интенсивность миграции эндотелиальных клеток линии EA. hy926 и сниженное их количество. Факторы, секретируемые плацентой при беременности, осложненной гестозом, индуцируют повышенную трансэндотелиальную миграцию моноцитоподобных клеток линии ТНР-1, сопровождающуюся усиленной экспрессией молекулы CD119 эндотелиальными клетками и усиленной экспрессией адгезионной молекулы CD11b моноцитоподобными клетками, что свидетельствует об участии этих молекул в индукции воспаления в плаценте при гестозе в условиях in vivo. Отмеченные изменения фенотипа эндотелиальных клеток линии EA. hy926 в присутствии секреторных продуктов плацент при гестозе, сопровождается снижением миграционной активности и количества эндотелиальных клеток, и могут лежать в основе индукции системной эндотелиальной дисфункции при гестозе. Изменение количества эндотелиальных клеток линии EA. hy926 может служить тест-системой для скрининга препаратов, предназначенных для терапии гестоза.

Реализация работы. По материалам диссертации опубликовано 27 научных работ, в том числе 9 статей в журналах, включенных в Перечень ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов диссертационных исследований.

Личное участие автора заключалось в проведении всех лабораторных исследований, статистической обработке, обобщении и анализе полученных результатов, подготовке статей. Методическая помощь была оказана в. н.с. отдела иммунологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН при освоении методов оценки миграционной активности ЭК и трансэндотелиальной миграции клеток линии ТНР-1.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на XII Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2009), XIII Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2009» (Санкт-Петербург, 2009), на Втором Международный конгрессе по иммунологии (Берлин, Германия, 2009), X юбилейном всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2009), XVI Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2010), 4-ой Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» (Пермь, 2010), I ежегодной научной конференции молодых ученых и специалистов «Репродуктивная медицина: взгляд молодых 2010» (Санкт-Петербург, 2010), Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2010), XIV Всероссийском форуме с международным участием им. академика «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011), XVII межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2011), XII Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2011), Международном студенческом медицинском конгрессе (ISCOM 2011) (Гронинген, Голландия, 2011), XIII Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2012), V Российской конференции по иммунологии репродукции (Иваново, 2012), III ежегодной научной конференции молодых ученых и специалистов «Репродуктивная медицина: взгляд молодых – 2012» (Санкт-Петербург, 2012), III Европейском конгрессе по иммунологии (Великобритания, Глазго, 2012).

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации включают введение, обзор литературы, описание материалов и методов, полученные результаты, обсуждение, общее заключение, выводы, список сокращений и список литературы. Текст диссертации изложен на 181 странице, содержит 24 таблицы, 21 рисунок и 4 приложения. Список литературы состоит из 296 работы, из них 43 работ принадлежит отечественным авторам и 253 - зарубежным.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Обследовано 110 женщин во время и вне беременности: первая (контрольная) группа – здоровые небеременные женщины без признаков воспалительных изменений в организме; вторая группа – женщины с физиологическим течением беременности (9-11 недель и 32-39 недель); третья группа – беременные женщины с гестозом различной степени тяжести (32-39 недель) без признаков угрожающего прерывания беременности на момент исследования. Группы беременных были сопоставимы по возрасту, прохождению родов и акушерскому анамнезу. Все плаценты на сроке 38-39 недель получены при родоразрешении путем кесарева сечения. Помимо плацент у женщин вышеперечисленных групп исследовали содержание различных факторов в сыворотке периферической крови. Получено информированное согласие пациенток на обследование. Диагноз гестоза у беременных женщин установлен на основании ведущих клинических симптомов в соответствии с классификацией, предложенной акад. РАМН (2005).

Культивирование плаценты проводили в среде DMEM/F12 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Sigma, США) или в среде DMEM/F12 без добавления ЭТС в течение 24 часов; кондиционированные среды собирали и замораживали (-20єС) до исследования. Кусочки плацент взвешивали для пересчета концентрации изучаемых факторов на 1мг ткани.

Измерение содержания факторов в сыворотке периферической крови и кондиционированных средах, полученных после культивирования плаценты, определяли методом иммуноферментного анализа используя стандартные наборы для Ang-1 и Ang-2, TRAIL (R&D systems, США), PlGF, sFas (CD95), sFasL (sCD95L) (Bender Medsystems, Австрия), MMP-2 и MMP-9 (Amersham Bioscieces, Великобритания) и CBA-методом для sE-Selectin, sICAM-3, sPECAM-1, sP-Selectin, sVCAM-1, sVEGF-R1 (Bender Medsystems, Австрия) на проточном цитофлуориметре FacsCantoII (BD, США).

Культуры клеток. Исследования проводили с использованием ЭК линии EA. Hy926 и моноцитоподобных клеток линии THP-1. Для культивирования ЭК линии EA. hy926 использовали среду следующего состава: среда DMEM/F12 (Sigma , США) с добавлением 10% инактивированной ЭТС, 100 Ед/мл пенициллина (Sigma, США) и 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma, США), 2 мМ L-глутамина (ICN, США), НАТ (Sigma, США). Для культивирования моноцитоподобных клеток линии ТНР-1 использовали среду следующего состава: среда RPMI1640 (Sigma, США) с добавлением 10% инактивированной ЭТС, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина. Все используемые клетки культивировали при 37єС, 5% СО2, 100% влажности.

Экспрессия поверхностных молекул эндотелиальными клетками в присутствии секретируемых плацентой факторов. ЭК культивировали в 24-луночных плоскодонных планшетах до образования конфлюэнтного монослоя. Затем ЭК инкубировали с кондиционированными средами, полученными после культивирования плацент. Затем клетки снимали с планшета и проводили связывание с антителами к CD31, CD62E, CD62P, CD34, CD9, CD54, CD51/61, CD29, CD49d, CD58, CD141, CD146, CD44, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, CD140a, CD140b, Tie-1, Tie-2, CD36, CD119, CD184, CD192, TRAIL (BD, США), меченными флуоресцентной меткой. Оценку экспрессии этих молекул проводили с использованием проточного цитофлуориметра FacsCanto II (BD, США).

Секреция цитокинов эндотелиальными клетками в присутствии факторов, продуцируемых плацентой. ЭК культивировали до образования конфлюэнтного монослоя. В лунки вносили кондиционированные среды, полученные после культивирования плацент, и инкубировали 3 часа. Клетки отмывали раствором Хенкса, вносили культуральную среду. После инкубации кондиционированные среды ЭК собирали и оценивали содержание VEGF, IL-8, bFGF, MCP-1, RANTES и ангиогенина при помощи СВА-метода, используя стандартный набор (BD, США) на проточном цитофлуориметре FacsCantoII. Содержание исследуемых цитокинов в культуральной среде не превышало 2 пг/мл.

Количество эндотелиальных клеток в присутствии секретируемых плацентой факторов, определение колориметрическим методом. ЭК инкубировали в 96-луночных плоскодонных планшетах. Вносили кондиционированные среды, полученные при культивировании плацент, с содержанием ЭТС 2,5%. После инкубации 72 часа ЭК окрашивали 0,2% раствором кристаллического фиолетового (Sigma, США), содержащим 5% метанола. Экстракцию красителя проводили 10% раствором уксусной кислоты. Учет оптической плотности проводили на микропланшетном ридере «Labsystems» (Финляндия) при длине волны 540 нм. Полученные значения оптической плотности переводили в количество клеток, используя калибровочную кривую.