Миграционная активность эндотелиальных клеток в присутствии факторов, секретируемых плацентой. ЭК культивировали в 96-луночном плоскодонном планшете до образования конфлюэнтного монослоя. Монослой нарушали, соскабливая часть клеток в центре лунки. Вносили кондиционированные среды, полученные при культивировании плацент с содержанием ЭТС 2,5%, и инкубировали 24 часа. ЭК окрашивали 0,2% раствором кристаллического-фиолетового, проводили оценку изменения ширины линии нарушенного монослоя в пикселях, и количество мигрировавших клеток на инвертированном микроскопе Axio Observer Z1 в компьютерной программе Axio Vision (Carl Zeiss, Германия).
Адгезия моноцитоподобных клеток линии ТНР-1 к эндотелиальным клеткам под влиянием факторов, секретируемых плацентой. ЭК культивировали в 24-луночном плоскодонном планшете до образования конфлюэнтного монослоя. Отмывали раствором Хенкса, вносили кондиционированные среды плацент. В качестве положительного контроля использовали TNFб в концентрации 50 Ед/мл. После инкубации с активаторами к ЭК, вносили моноцитоподобные клетки, предварительно окрашенные флуоресцентным витальным красителем CFSE (Sigma, США). Совместное культивирование ЭК и моноцитоподобных клеток проводили в течение 1 часа, после чего неадгезировавшие клетки линии ТНР-1 отмывали раствором Хенкса. Адгезировавшие моноцитоподобные клетки и ЭК переводили в суспензию и измеряли количество клеток каждого типа в полученной суспензии на проточном цитофлуориметре FACSCanto II.
Трансэндотелиальная миграция моноцитоподобных клеток через монослой эндотелиальных клеток под влиянием факторов, секретируемых плацентой. ЭК инкубировали во вставках для 24-луночных планшетов с поликарбонатным фильтром (размер пор 8 мкм) до образования монослоя. Затем в верхнюю камеру вносили моноцитоподобные клетки. В нижнюю камеру (лунка 24-луночного планшета) вносили кондиционированные среды плацент, инкубировали 24 часа. Оценивали абсолютное количество мигрировавших в нижнюю камеру клеток линии THP-1 и их фенотип после связывания с антителами против молекул CD18, CD11a, CD11b и CD11c, мечеными флуоресцентной меткой (BD, США), на проточном цитофлуориметре.
Оценка влияния препарата на основе магния аспарагината на изменение количества эндотелиальных клеток. Водорастворимый препарат на основе магния аспарагината ( «Полисан», Россия) содержит магния аспарагинат (5 г/л), натрия сукцинат (1г/л); рН =7,2. Для изучения влияния препарата на количество ЭК в 96-луночном круглодонном планшете (Sarstedt, Австрия) готовили серию разведений препаратов от чистого препарата до разведения 1:1024 в объеме 100 мкл на среде DMEM\F12, ЭТС 2,5%. Методика определения изменения количества ЭК описана выше. В качестве контроля использовали препарат «Натрия хлорид», который не оказывал токсического действия на ЭК, а также не влиял на изменение их количества.
Статистический анализ проводили в программе Statistica 7.0 при помощи непараметрических критериев Манна-Уитни, Вилкоксона, а также медианного теста, используемого для определения тенденции изменения признака [Makhseed М., 2001]. Для оценки влияния препарата магния на количество ЭК использовали критерий Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Секреция плацентой биологически активных молекул. В III триместре физиологической беременности секреция плацентой Ang-2, MMP-2, PlGF, sVEGF-R1 была ниже по сравнению с I триместром, а секреция Ang-1 выше (табл. 1). При гестозе секреция плацентой Ang-1 и Ang-2 была ниже, а sVEGF-R1 – выше по сравнению с III триместром физиологической беременности. Полученные результаты указывают на участие изученных факторов в ограничении ангиогенеза к концу беременности и нарушении ангиогенеза в плаценте при гестозе, что может быть связано с нарушением секреторной активности макрофагов и ЭК.
Таблица 1
Продукция плацентой ангиогенных молекул
Ангиогенные молекулы | Группы | Концентрация в 1мл кондиционированной среды, пг/мл | Концентрация в пересчете на 1мг ткани |
PlGF | 9-11 недель (n=15) | 530±75 | 6,7±1,0 |
38-39 недель (n=27) | 340±35* | 3,5±0,4* | |
гестоз, 38-39 недель (n=28) | 300±32 | 3,0±0,3 | |
MMP-2 | 9-11 недель (n=15) | 114700±10300 | 1467±147 |
38-39 недель (n=27) | 42700±2300 * | 480,9±26,4* | |
гестоз, 38-39 недель (n=28) | 45290±1833 | 511,0±28,4 | |
MMP-9 | 9-11 недель (n=15) | 8024±1127 | 102,9±14,4 |
38-39 недель (n=27) | 8627±1544 | 84,1±11,7 | |
гестоз, 38-39 недель (n=28) | 10251±668 | 109,9±7,5 | |
Ang-1 | 9-11 недель (n=15) | 0,27±0,27 | 0,003±0,003 |
38-39 недель (n=27) | 71,8±12,0 * | 0,82±0,15 * | |
гестоз, 38-39 недель (n=28) | 53,7±12,6 | 0,59±0,15 | |
Ang-2 | 9-11 недель (n=15) | 37789±3268 | 476±48 |
38-39 недель (n=27) | 3188±698 * | 39,8±10,2 * | |
гестоз, 38-39 недель (n=28) | 1518±322 | 16,4±3,7 |
* - p<0,05 по сравнению с группой «9-11 недель».
В III триместре физиологической беременности секреция sFasL ниже, а секреция TRAIL выше по сравнению с I триместром (табл.2), что может являться механизмом защиты клеток плаценты от цитотоксических эффектов лимфоцитов матери в III триместре беременности. При гестозе секреция плацентой sFas (табл. 2) и sFasL (медианный тест) повышена по сравнению с физиологической беременностью, что, вероятно, вносит вклад в инициацию апоптоза цитотоксических лимфоцитов матери при данной патологии и предотвращение апоптоза клеток плаценты.
Таблица 2
Продукция плацентой секреторных вариантов поверхностных молекул
Секретор-ные молекулы | Группы | Концентрация в 1мл кондиционированной среды, пг/мл | Концентрация в пересчете на 1мг ткани |
sFas (sCD95) | 9-11 недель (n=15) | 299±40 | 4,0±0,7 |
38-39 недель (n=30) | 278±16 | 3,0±0,2 | |
гестоз, 38-39 недель (n=35) | 331±19 ‡ | 3,4±0,2 | |
sFasL (sCD95L) | 9-11 недель (n=15) | 50,9±9,3 | 0,6±0,1 |
38-39 недель (n=30) | 16,8±3,5* | 0,18±0,03* | |
гестоз, 38-39 недель (n=35) | 26,0±4,7 | 0,27±0,05 | |
TRAIL | 9-11 недель (n=15) | 25,9±4,7 | 0,33±0,06 |
38-39 недель (n=30) | 411±42* | 4,2±0,4* | |
гестоз, 38-39 недель (n=35) | 399±31 | 4,4±0,3 | |
sVE-cadherin (sCD144) | 9-11 недель (n=15) | 0,1±0,1 | 0,001±0,001 |
38-39 недель (n=30) | 307±118* | 2,8±1,0* | |
гестоз, 38-39 недель (n=35) | 665±155 ‡ | 7,0±1,6‡ | |
sVEGF-R1 | 9-11 недель (n=15) | 77000±528 | 1000±69 |
38-39 недель (n=30) | 28514±306* | 314±26* | |
гестоз, 38-39 недель (n=35) | 40779±401‡ | 491±54 ‡ | |
sPECAM-1 | 9-11 недель | 17493±2178 | 208,7±26,6 |
38-39 недель | 51814±5086* | 493±39* | |
гестоз, 38-39 недель | 67872±6364 | 678±57 ‡ | |
sICAM-3 | 9-11 недель | 3233±737 | 38,3±8,8 |
38-39 недель | 1706±547* | 18±6,1* | |
гестоз, 38-39 недель | 970±407 ‡ | 10,0±4,3 | |
sE-Selectin | 9-11 недель | 948±329 | 11,1±3,9 |
38-39 недель | 4659±550* | 48,9±6,6* | |
гестоз, 38-39 недель | 3918±580 | 40,7±6,7 | |
sP-Selectin | 9-11 недель | 28310±5329 | 348,6±64,7 |
38-39 недель | 23517±4700 | 214±43 | |
гестоз, 38-39 недель | 23732±5734 | 239±55 | |
sVCAM-1 | 9-11 недель | 6704±784 | 79,7±9,3 |
38-39 недель | 10912±995* | 113±11 | |
гестоз, 38-39 недель | 8550±543 | 90±7 |
* - p<0,05 по сравнению с группой «9-11 недель», ‡.- p<0,05 по сравнению с группой «38-39 недель».
Установлено, что секреция плацентой молекулы sVE-cadherin на сроке 9-11 недель отсутствует. В III триместре физиологической беременности секреция плацентой sVE-cadherin, sPECAM-1, sE-selectin, sVCAM-1 была выше по сравнению с I триместром, что может быть связано с усилением процессов апоптоза в плаценте к концу беременности. При этом секреция sICAM-3 снижена (табл. 2), что коррелирует со снижением привлечения лейкоцитов в плаценту к концу беременности. Секреторные варианты адгезионных молекул могут принимать участие в регуляции привлечения лейкоцитов в плаценту.
Гестоз сопровождался повышенной секрецией sVE-cadherin плацентой по сравнению с физиологической беременностью, сниженной секрецией молекул sE-selectin, sVCAM-1 (по результатам медианного теста), sICAM-3 (табл.2), что может являться результатом их связывания с лигандами на поверхности лейкоцитов. При гестозе изменение секреции растворимых форм адгезионных молекул плацентой может служить механизмом, сдерживающим миграцию лейкоцитов матери в децидуальную оболочку и плаценту, а также снижающим цитотоксические эффекты лейкоцитов матери в отношении клеток плода. Изменение секреции растворимых форм поверхностных молекул плацентой не вносило вклад в их содержание в сыворотке периферической крови беременных женщин, что указывает на роль изученных молекул в местной регуляции развития плаценты.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 |
