Изучение роли метаботропной активности а7 никотинового ацетилхолинового рецептора человека в никотин-индуцированном развитии раковых опухолей

Автор заявки:

Подразделение:

Группа биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов

Тема научного исследования:

Изучение роли метаботропной активности а7 никотинового ацетилхолинового рецептора человека в никотин-индуцированном развитии раковых опухолей.

Программа:

Онкологические заболевания являются второй по распространенности причиной смерти населения после заболеваний сердечно-сосудистой системы, как в России, так и в мире, поэтому поиск новых эффективных стратегий терапии опухолей входит в список приоритетных проблем современной медицины. Известно, что с употреблением никотина (табака) связано развитие рака головы, шеи, груди, легкого, поджелудочной железы, толстой кишки, желудка и мочевого пузыря. Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (nAChR) являются лиганд-зависимыми ионными каналами, обнаруженными во многих тканях человека. В последнее время появились данные о вовлечении этих рецепторов в процессы клеточной пролиферации, дифференцировки, миграции и апоптоза.

       Стимуляция не-нейрональных nAChR никотином и его нитрозаминовыми производными (NNK и NNN) является одной из возможных причин развития онкологических заболеваний, вызванных употреблением табака. Например, показано что NNK и NNN вызывают злокачественную трансформацию кератиноцитов через активацию nAChR. Активация б7-nAChR никотином в эпителиальных клетках  может приводить к передаче сигнала через сигнальные каскады рецепторов EGF и VEGF, а также – через в-адренергические рецепторы, что, в свою очередь, приводит к активации митогенных, анти-апоптотических и пролиферативных транскрипционных факторов. Кроме того, показано, что a7-nAChR способны образовывать  комплексы с EGF в раковых клетках (Chernyavsky et al., 2015). В настоящее время механизм сопряжения сигнальных путей б7-nAChR с рецепторами EGF и в-адренергическими рецепторами остается малоизученным.

В качестве одного из возможных объяснений такого сопряжения сигнальных путей может выступать механизм метаботропной передачи сигнала через б7-nAChR, т. е. непосредственная активация белков в составе какого-либо внутриклеточного сигнального каскада, не связанная с прохождением ионов кальция через канал рецептора. В качестве возможных метаботропных «партнеров» а7 nAChR в различных литературных источниках фигурируют в-аррестин, киназа Jak2, G-белки семейств Gбq и Gбs, EGF, VEGF. Внутриклеточный домен б7-nAChR по своей аминокислотной последовательности напоминает G-белок связывающий домен канала GIRK1 и значительно отличается от внутриклеточных доменов других представителей семейства nAChR. Возможно, метаботропная активность является уникальным свойством рецептора б7-nAChR. Изучение специфического для б7-nAChR механизма передачи сигнала по метаботропному пути может стать основой для разработки лекарственных препаратов, селективно подавляющих развитие раковых клеток, вызванное активацией б7-nAChR. 

Целью проекта является исследование метаботропной активности никотинового рецептора а7 типа в раковых линиях эпителиального происхождения, идентификация вовлеченных в метаботропный эффект сигнальных каскадов и поиск методов селективной стимуляции/ингибирования данного сигнального пути.

Для достижения целей проекта в течение 3 лет планируется решить следующие задачи:

1 год:

       1. Идентификация сигнального пути, активируемого метаботропной активностью б7-nAChR с помощью специфических ингибиторов белков, участвующих в инициации внутриклеточных сигнальных путей в различных клеточных линиях (эпидермальная аденокарцинома A431, легочная карцинома A549, в качестве контроля будут использованы клетки HEK293, продуцирующие б7-nAChR).

       2. Исследование ассоциации б7-nAChR в модельных линиях с компонентами метаботропного сигнального пути с помощью кросс-сшивающих агентов и аффинной экстракции.

2 год:

       1. Разработка метода количественного измерения метаботропной активности б7-nAChR в культуре.

       2. Идентификация биоинформатическими методами в последовательности б7-nAChR аминокислотного мотива, отвечающего за активацию метаботропного сигнального пути.

3. Проверка функциональности данного мотива на клеточных линиях НЕК293, экспрессирующих б7-nAChR дикого типа и мутантные варианты б7-nAChR с заменами в предполагаемом «метаботропном» мотиве.

3 год:

       1. Поиск условий селективной стимуляции/ингибирования метаботропной активности б7-nAChR.

       2. Изучение влияния активации/ингибирования метаботропного пути на пролиферацию/миграцию нормальных и опухолевых клеток эпителиального происхождения.

Календарный план:

Содержание НИР	Сроки	Ожидаемые результаты
1. Идентификация сигнального пути, активируемого метаботропной активностью а7 nAChR с помощью специфических ингибиторов белков, участвующих в инициации внутриклеточных сигнальных путей в различных клеточных линиях (A431, A549, HEK293, продуцирующей а7-nAChR). 2. Исследование ассоциации а7 nAChR с компонентами метаботропного сигнального пути с помощью кросс-сшивающих агентов и аффинной экстракции.	1 год	1) Будет исследовано влияние специфических ингибиторов различных внутриклеточных сигнальных путей (Gq, Gi/Gs, Jak2, bArr) на снижение пролиферации клеток линий А431, A549, HEK293, продуцирующей а7-nAChR), вызванное различными лигандами, ингибирующими пролиферацию клеток через взаимодействие с а7-nAChR. 2) Для клеточной линии с подтвержденной метаботропной активностью будет разработан и оптимизирован протокол аффинной экстракции комплекса б7-nAChR с компонентами внутриклеточного сигнального пути с помощью химической кросс-сшивки и иммобилизованного специфического лиганда б7-nAChR (например, б-бунгаротоксина). 3) Наличие компонентов предполагаемого метаботропного сигнального пути в экстрагированном комплексе будет проанализировано с помощью вестерн-блота.
1. Разработка метода количественного измерения метаботропной активности а7 в культуре. 2. Идентификация биоинформатическими методами в последовательности а7 nAChR аминокислотного мотива, отвечающего за активацию метаботропного сигнального пути. 3. Проверка функциональности данного мотива на клеточных линиях, продуцирующих а7 nAChR дикого типа и мутантные варианты а7 nAChR.	2 год	1) Будет разработан метод измерения метаботропной активности б7-nAChR на основе измерения концентраций вторичных мессенджеров или активности белков – внутриклеточных компонентов идентифицированного сигнального пути. 2) Будет проведен анализ аминокислотной последовательности и модели структуры рецептора в сравнении с рецепторами, вызывающими активацию сигнального каскада, ассоциированного с метаботропной активностью б7-nAChR. По результатам проведенного анализа будет выдвинуто предположение об участках аминокислотной последовательности, участвующих во взаимодействии с компонентами метаботропного сигнального пути б7-nAChR 3) Функциональность выявленного мотива будет подтверждена с помощью экспериментов на линиях НЕК293, продуцирующих как б7-nAChR дикого типа, так и варианты б7-nAChR с мутациями в участке, отвечающем за передачу метаботропного сигнала.
1. Поиск условий селективной стимуляции/ингибирования метаботропной активности б7-nAChR. 2. Изучение влияния активации/ингибирования метаботропного пути на пролиферацию/миграцию нормальных и опухолевых клеток эпителиального происхождения.	3 год	1) Будут подобраны лиганды/комбинации лигандов, вызывающие стимуляцию или ингибирование метаботропной активности б7-nAChR, не влияя при этом на ионотропную активность рецептора. 2) Будет исследовано влияние селективной активации/ингибирования метаботропной активности б7-nAChR на пролиферацию и миграцию клеток линий А431, А549 и НЕК293, продуцирующих б7-nAChR.