Устойчивость к антибиотикам энтеробактерий (стр. 3 )

6.3 Механизм действия бета-лактамаз

Обязательным компонентом наружной мембраны прокариотических микроорганизмов (кроме микоплазм) является пептидогликан, представляющий собой биологический полимер, состоящий из параллельных полисахаридных цепей. Пептидогликановый каркас приобретает жесткость при образовании между полисахаридными цепями поперечных сшивок. Поперечные сшивки образуются через аминокислотные мостики, замыкание сшивок осуществляют ферменты карбокси - и транспептидазы (ПСБ). Бета-лактамные антибиотики способны связываться с активным центром фермента и подавлять его функцию. Специфическая активность антибиотиков определяется наличием бета-лактамного кольца. Боковые радикалы определяют фармакокинетические особенности, устойчивость к действию бета-лактамаз и другие второстепенные свойства [Сидоренко, Яковлев, 1997].

Бета-лактамазные ферменты разрушают бета-лактамное кольцо двумя основными механизмами. Первый механизм, присущий лактамазам классов А, С и D (деление на классы проводится в зависимости от последовательности аминокислот в структуре фермента), заключается в связывании с субстратом благодаря наличию специального гибкого активного участка. Происходит необратимое связывание с углеродом карбонильной группы бета-лактамного кольца и нарушение его целостности, что переводит антибиотик в неактивное состояние и попутно обеспечивает регенерацию бета-лактамазы. Эти классы бета-лактамаз активны в отношении многих пенициллинов, цефалоспоринов и монобактамов. Второй механизм присущ менее распространенной группе бета-лактамаз, которые относятся к классу В. Ферменты этого класса называются также металло-бета-лактамазами, поскольку содержат подвижный двухвалентный ион металла, чаще всего ион цинка, который способен связываться с карбонильной группой большинства пенициллинов, цефалоспоринов и карбапенемов, но не монобактамов [Богун, 2007].

6.4. Ингибиторы бета-лактамаз

Широко используемыми ингибиторами в-лактамаз являются:

– клавулановая кислота

– пенициллановые кислоты

– сульбактам (сульфон пенициллановой кислоты)

– 6 - хлорпенициллановая кислота

– 6 - бромпенициллановая кислота

– 6 - ацетилпенициллановая кислота

Различают два типа ингибиторов бета-лактамаз. К первой группе относят антибиотики, стабильные к действию ферментов. Такие антибиотики помимо антибактериальной активности обладают ингибиторными свойствами на бета-лактамазы, проявляющиеся при высокой концентрации антибиотиков. К ним относят метициллин, изоксазолилпенициллины, моноциклические бета-лактамы типа карбапенема. Вторую группу составляют ингибиторы бета-лактамаз, проявляющие в низких концентрациях ингибиторную активность, а в высоких обладающие антибактериальными свойствами. Примером может служить клавулановая кислота, сульбактам [Белоусов, Моисеев, Лепахин, 2006].

7 Решение проблемы бета-лактамазной резистентности

Большинство штаммов бактерий способно продуцировать в-лактамазы нескольких типов. Имеется несколько вариантов решения проблемы в-лактамазной резистентности:

– Поиск новых в-лактамных антибиотиков, которые не подвержены гидролизу под действием в-лактамаз (новые цефалоспорины, монобактамы, тиенамицины) [Козлов, Веселов, 2006].

– Синтез бета–лактамазоустойчивых антибиотиков. Примерами являются оксациллин, цефазолин (устойчивы к эффекту стафилококковых “пенициллиназ”), цефалоспорины III–IV поколений (устойчивы к бета–лактамазам широкого спектра грамотрицательных бактерий) и, конечно, карбапенемы, активные в отношении бета–лактамазопродуцирующих штаммов большинства актуальных патогенов;

– Использование комбинаций антибиотиков с ингибиторами бета–лактамаз, которые призваны повысить (восстановить) активность антибиотиков в отношении бактерий, вырабатывающих гидролизующие энзимы [Карпов, 2005].

Многообразие в-лактамаз, их широкое распространение среди грамотрицательных бактериальных возбудителей инфекций и одновременно ведущая роль в формировании устойчивости к в-лактамным антибиотикам диктуют необходимость всестороннего изучения и внедрения в широкую практику надежных и максимально стандартизованных методов их диагностики. В частности, важное практическое значение имеет использование клинико-диагностическими лабораториями чувствительных хромогенных тестов для выявления продукции в-лактамаз у госпитальных штаммов энтеробактерий. Успех в решении этой задачи в значительной степени определяется возможностью комплексного использования современных фенотипических и молекулярно-генетических методов исследования [Эйдельштейн, 2001].

8 Методы определения чувствительности к антибиотикам

Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам делятся на 2 группы: диффузионные и методы разведения.

8.1 Диско-диффузионный метод

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам с помощью дисков является наиболее простым, удобным и широко используемым методом при рутинном микробиологическом исследовании чувствительности обычных быстрорастущих и некоторых "привередливых" микроорганизмов. Однако необходимо помнить, что на результаты определения чувствительности могут влиять многие факторы, такие, как состав, pH, толщина и равномерность слоя питательной среды, содержание в ней ионов Сa2+ и Mg2+, плотность инокулюма, возраст культуры, скорость роста микроорганизма, условия инкубации (температура, атмосфера), скорость диффузии антибиотика в агар и т. д. Поэтому эта методика требует использования определенного агара, неукоснительного соблюдения правил его приготовления, обязательной стандартизации инокулюма, строгого соблюдения условий инокуляции и инкубации чашек, правильного и регулярного проведения процедур по контролю качества [Стецюк, Решедько, Рябкова, 1999].

При определении чувствительности диско-диффузионным методом на поверхность агара в чашке Петри наносят бактериальную суспензию определенной плотности (обычно эквивалентную стандарту мутности 0,5 по McFarland) и затем помещают диски, содержащие определенное количество антибиотика. Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков. После инкубации чашек в термостате при температуре 35о-37оС в течение ночи учитывают результат путем измерения диаметра зоны вокруг диска в миллиметрах.

Определение чувствительности микроорганизма с помощью Е-теста проводится аналогично тестированию диско-диффузионным методом. Отличие состоит в том, что вместо диска с антибиотиком используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной. В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е-теста получают значение минимальной подавляющей концентрации (МПК) [Решедько, 1999].

На основании полученных диаметров зон подавления роста микроорганизма вокруг дисков с антибиотиками тестируемые штаммы подразделяют на чувствительные, умеренно резистентные и резистентные. Для разграничения этих трех категорий чувствительности (или резистентности) между собой используют так называемые пограничные значения (breakpoints) диаметров зон подавления роста микроорганизмов. Пограничные значения не являются неизменными величинами. Они могут пересматриваться с течением времени в зависимости от получения новых данных о механизмах антибиотикорезистентности. Следует отметить, что диаметры зон подавления роста микроорганизмов вокруг дисков с антибиотиками в определенных пределах обратно пропорциональны концентрации антибиотиков, подавляющей рост бактерий.

Таким образом, размер зоны подавления роста позволяет косвенно судить о концентрации антибиотика, подавляющей рост данного штамма микроорганизма [Решедько, Стецюк, 2001].

Однако диско-диффузионный метод позволяет лишь косвенно судить о величине МПК, а результатом исследования является отнесение микроорганизма к одной из категорий чувствительности (чувствительный, промежуточный или резистентный) [Определение чувствительности…, 2004].

8.2 Метод серийных разведений антибиотиков

Методы серийных разведений основаны на прямом определении основного количественного показателя, характеризующего микробиологическую активность АБП - величины его минимальной подавляющей концентрации (МПК). В зависимости от характера используемой питательной среды различают методы серийных разведений в агаре или в бульоне. В зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют методы серийных макро - и микроразведений. Разновидностью метода серийных разведений является также метод, основанный на использовании только двух концентраций АБП, соответствующих пограничным значениям МПК. Этот принцип исследования широко используется в автоматизированных системах для определения чувствительности микроорганизмов. Диффузионные методы определения чувствительности основаны на диффузии АБП из носителя в плотную питательную среду и подавлении роста исследуемой культуры в той зоне, где концентрация АБП превосходит МПК [Определение чувствительности…, 2004].

Точность всех измерений и манипуляций является критическим моментом, влияющим на качество и достоверность полученных данных. Поэтому необходимо использовать только химически чистые субстанции антибиотиков с известной активностью, для их взвешивания использовать электронные лабораторные весы с точностью до 4-ого знака, для измерения объема – калиброванные дозаторы и пипетки [Определение чувствительности…, 2003].

9 Последствия антибиотикорезистентности микроорганизмов

К сожалению, вслед за оптимистическими результатами антибиотикотерапии, широкой разработкой и внедрением новых классов антибактериальных средств все отчетливее и значимо давал о себе знать феномен антибиотикорезистентности. По образному выражению профессора антибиотикорезистентность на современном этапе является «угрозой национальной безопасности». Да, в действительности приходится признавать, что антибиотикам во многих случаях нет альтернативы и даже внедрение в практику новых вакцин, генной инженерии будет недостаточно для преодоления столь масштабной проблемы. Потеря антибиотиков по ряду причин явилась бы катастрофой для современной цивилизации в связи с тем, что:

– резко выросла бы смертность от пока управляемых инфекций (менингит, пневмония, перитонит и пр.).