Модуль 2. Санитарно-гигиеническая экспертиза и гигиеническая оценка факторов среды обитания человека

ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия Минздрава РФ»

Кафедра общей и коммунальной гигиены

Дисциплина: Санитарно-гигиеническая лабораторная диагностика

Курс – 3  Специальность:

060105.65

Медико-профилактическое дело

Семестр 5

Модуль 2. Санитарно-гигиеническая экспертиза и гигиеническая оценка факторов среды обитания человека.

Практическое занятие №10

Основы хроматографических методов анализа, область применения, преимущества и недостатки. Хроматографический метод КХА в санитарно-гигиенических испытаниях (для анализа воздуха, воды, пищевых продуктов). Отечественное и зарубежное оборудование для выполнения хроматографического анализа. Основы тонкослойной хроматографии.

Методическое пособие для преподавателей

к проведению практического занятия

Авторы: асс , асс

Утверждено на заседании кафедры общей и коммунальной гигиены

«__» ____ 2013

Оренбург 2013

Тема: Основы хроматографических методов анализа, область применения, преимущества и недостатки. Хроматографический метод КХА в санитарно-гигиенических испытаниях (для анализа воздуха, воды, пищевых продуктов). Отечественное и зарубежное оборудование для выполнения хроматографического анализа. Основы тонкослойной хроматографии.

2. Цель: Формирование у студентов знаний о сущности хроматографических методов анализа.

Обучающая: сформировать у студентов понимание хроматографических методов анализа.

Развивающая: способствовать развитию у студентов потребности и мотивы профессионального становления и развития, формировать знания о хроматографических методах анализа, об органических загрязнителях пищевых продуктов, воды.

Воспитывающая: воспитывать стремление к повышению своего общекультурного, интеллектуального и профессионального уровня, интерес к санитарно – гигиенической лабораторной диагностике как теоретической  и практической основе профессиональной деятельности, формировать ценностное отношение к профессии врача медико-профилактического дела и значимость владения гигиеническими знаниями для жизнедеятельности человека.

4. Вопросы для рассмотрения:

1.) Хроматографические методы анализа. Виды, классификация хроматографических методов анализа.

2.) Область применения хроматографических методов исследования.

3.) Хроматографический метод количественного химического анализа в сани­тарно-гигиенических исследованиях воды, воздуха, почвы, пищевых продуктов.

4.) Оборудование для проведения хроматографических исследований.

5.) Основы тонкослойной хроматографии.

6.) Методы пробоподготовки для проведения хроматографического анализа

Область применения хроматографии. На сегодняшниий день метод газовой хроматографии является одним из самых востребованных методов многокомпонентного анализа, применяемых в хроматографах, поскольку его отличает экспрессность, высокая точность, чувствительность, автоматизация. Метод применяется для решения многих аналитических проблем. Самостоятельным аналитическим методом, используемым при работе с хроматографом, можно считать количественный газохроматографический анализ. Он более эффективен при разделении веществ, относящихся к одному и тому же классу (углеводороды, органические кислоты, спирты и т. д.). Данный метод нашел широкое применение в нефтехимии (бензины содержат сотни соединений, а керосины и масла — тысячи), он незаменим при определении пестицидов, удобрений, лекарственных препаратов, витаминов, наркотиков и др.

ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

1. ОСНОВЫ МЕТОДА

Хроматография [гр. сhromatos −цвет + grapho −пишу] — метод разделения,

анализа и физико-химических исследований веществ, основанный на

перемещении зоны вещества вдоль слоя сорбента в потоке подвижной фазы

с многократным повторением сорбционных и десорбционных актов. При этом разделяемые вещества распределяются между двумя несмешивающимися фазами (в зависимости их относительной растворимости в каждой фазе):

подвижной и неподвижной.

Хроматография  открыта в начале ХХ века (первая научная статья опубликована в  1905г) Российским ученым . Основные виды хроматографии это – газовая, жидкостная и тонкослойная.

Газовая хроматография: хроматография, в которой подвижная фаза находится в состоянии газа или пара, газ-носитель - инертный газ.

Неподвижной фазой (НЖФ) является высокомолекулярная жидкость, закрепленная на пористый носитель или на стенки длинной капиллярной трубки. Газовая хроматография - универсальный метод разделения смесей

разнообразных веществ, испаряющихся без разложения. При этом компоненты разделяемой смеси перемещаются по хроматографической колонке с потоком газа-носителя. По мере движения разделяемая смесь многократно распределяется между газом-носителем (подвижной фазой) и нелетучей неподвижной жидкой фазой, нанесенной на инертный мате риал (твердый носитель), которым заполнена колонка.

Принцип разделения - неодинаковое сродство веществ к летучей подвижной фазе и стационарной фазе в колонке. Компоненты смеси селективно задерживаются в колонке, поскольку растворимость их в этой фазе различна, и таким образом разделяются (компонентам с большей растворимостью требуется большее время для выхода из жидкой фазы, чем компонентам с меньшей растворимостью). Затем вещества выходят из колонки и регистрируются детектором. Сигнал детектора записывается в виде хроматограммы  автоматическим потенциометром (самописцем) или же регистрируется компьютером. Хроматография один из наиболее распространенных физико - химических методов исследования. Хроматографические методы широко используются в химии и биохимии, находят применение в химической, нефтехимической, металлургической, фармацевтической, пищевой и других отраслях промышленности. С повышением экологических требований к среде обитания, продуктам питания, лекарствам естественно находят свое отражение в исследовании охраны окружающей среды и медицине, а также в других областях науки и промышленности. Круг решаемых задач и практическое использование хроматографии непрерывно расширяется.

2 ПРИНЦИПИАЛЬНАЯ СХЕМА ГАЗОВОГО ХРОМАТОГРАФА

Газовый хроматограф представляет собой прибор, использующий принцип хроматографии в системах газ-адсорбент или газ-жидкость. В аппаратурном оформлении это совокупность нескольких самостоятельных, параллельно функционирующих систем: источник газа-носителя и блок ьподготовки газов, испаритель, термостат колонок и сами хромато - графические колонки, детектор, система регистрации и обработки данных. Типичная блок-схема газового хроматографа изображена на рисунке 1.

Рис 1. Схема газового хроматогафа.

3 СУЩНОСТЬ И КЛАССИФИКАЦИЯ МЕТОДОВ ХРОМАТОГРАФИИ

В основу той или иной классификации хроматографических методов могут быть положены различные характерные признаки процесса. При этом следует учитывать, что существуют промежуточные варианты, не укладывающиеся в рамки строгой классификации. Более того, именно такие промежуточные варианты часто оказываются весьма перспективными и даже единственно возможными для решения сложных задач анализа.

Разнообразные варианты хроматографии укладываются в относительно простую схему классификации в зависимости от используемойт подвижной фазы и характера межмолекулярных взаимодействий.

4 ХРОМАТОГРАММА

Каждому компоненту смеси на хроматограмме соответствует отдельный пик

- максимум регистрируемого сигнала детектора или концентрации компонента хроматографируемой смеси в элюенте. Кривую зависимости сигнала детектора от объема газа-носителя или от времени называют хроматограммой (элюционной кривой). В зависимости от типа используемого детектора получают дифференциальные и интегральные хроматограммы. На дифференциальной хроматограмме различают следующие со ставные части: нулевую линию 1 – участок хроматограммы, полученной при регистрации сигнала дифференциального детектора во время выхода из колонки чистого газа-носителя;

пик 2 – несорбирующегося компонента; пик 3 – участок хроматограммы,

полученной при регистрации сигнала детектора во время выхода из колонки

одного из определяемых компонентов (или смеси нескольких неразделенных

компонентов). Пик ограничивается фронтом, соответствующим возрастанию концентрации компонента до максимальной, и тылом, отвечающим убыванию концентрации компонента в газе-носителе.

5 ЭЛЮЦИОННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Первичные параметры удерживания

К числу первичных параметров удерживания относятся: время удерживания,

объем удерживания и соответствующий им отрезок на хроматограмме - расстояние удерживания.

Время удерживания (tR) - это время, прошедшее от момента ввода пробы

до выхода максимума концентрации определяемого компонента. Время

удерживания экспериментально определяется по секундомеру либо с помощью интегратора или системы автоматизации анализа(САА) и измеряется в минутах и секундах (n’n”). Каждое вещество (компонент) имеет свое время выхода.

6 ГАЗЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В ХРОМАТОГРАФИИ

В подавляющем большинстве случаев применяются газы, сжатые до давления 15 МПа и содержащиеся в баллонах емкостью 40 л. В случаях, когда невозможно или трудно транспортировать стальные баллоны с газами, применяются электролитические или химические генераторы водорода, кислорода, углекислого газа и др.

Аргон обычно поставляют достаточно чистым, и поэтому он не нуждается в

дополнительной очистке. Применять аргон в качестве газа - носителя выгодно, поскольку он не взрывоопасен и сравнительно дешев.

Азот, применяемый в хроматографии, имеет степень чистоты, равную 99,99% поэтому он также не нуждается в дополнитель ной очистке.

То же относится и к гелию: в случае использования детектора по теплопроводности или пламенно-ионизационного детектора этот газ не нужно дополнительно очищать.

Электролитический водород удобен для хроматографии и также поставляется в баллонах или генерируется непосредственно в лабораторном электролизере. Степень его чистоты обычно равна  99.8%, что вполне достаточно для рутинной работы. При более высоких требованиях, предъявляемых к чистоте, водород необходимо освобождать от остатков кислорода и от влаги. Из-за очень низкой вязкости водорода перед началом работы необходимо проверить все соединения и полностью устранить все неплотности в генераторе.

Что касается вспомогательных газов, то кислород и воздух обычно подвергают дополнительной сушке; если воздух отбирается из компрессора, то на его пути устанавливают еще и фильтр для улавливания компрессорного масла.

7. НЕПОДВИЖНЫЕ ЖИДКИЕ ФАЗЫ

Неподвижная жидкая фаза - это фаза, определяющая селективные

взаимодействия между компонентами пробы и твердым носителем, т. е. определяет последовательность выхода из колонки и отношение времен удерживания максимумов их зон, а также характер размывания хроматографических зон.

Выбор неподвижной жидкой фазы может оказаться наиболее важным шагом

для получения требуемых хроматографических данных. При выборе НЖФ принимаются во внимание следующие свойства:

- химическая стойкость и инертность;

- низкое давление пара при температуре колонки;

- достаточные коэффициенты разделения;

- достаточная селективность по отношению к компонентам пробы,

которые должны быть разделены;

- низкая вязкость;

- хорошая растворимость в каком-либо летучем растворителе;

- доступность.

7.1 Типы неподвижных фаз для капиллярной хроматографии

Для получения качественных капиллярных колонок необходимо, чтобы унос фазы из колонки был низким. Многие фирмы, специализи рующиеся на выпуске колонок, сами выпускают НЖФ. Однако результа ты анализов, выполненных с использованием аналогичных НЖФ, могут не совпадать. Поэтому кроме названия типа колонки указывается и производитель.

8. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ КОЛОНКИ

Хроматографическая колонка представляет собой трубку с фиксированной

неподвижной жидкой фазой, через которую протекает подвижная фаза.

В зависимости от расположения неподвижной фазы колонки

делятся на насадочные (набивные) и капиллярные (таблица 1).

Таблица 9.

Типы хроматографических колонок

Колонки	диаметр dk, мм	Длина Lk, м	Объем Vk, см3
Насадочные	2,0−6,0	0,5−5,0	1,5−141
Микронасадочные	0,5−1,0	0,1−2,0	0,02−1,5
Капиллярные	0,05−0,5	10−200	0,02−39,2

8.1 Насадочные (набивные) колонки

Насадочные колонки наполнены адсорбентом (система газ−адсорбент) или инертным твердым носителем, обработанным жидкой неподвижной фазой (система газ−жидкость).

Материалом для насадочных колонок является нержавеющая сталь, никель, медь, алюминий, стекло или фторопласт. Металлические колонки отличаются прочностью.

Их легко термо статировать и перед использованием следует тщательно очищать (раствором соляной кислоты, органическими растворителями). Не всегда пригодны для анализа жирных кислот. Медные и алюминиевые колонки используют для анализа углеводородов и других инертных соединений. Колонки из фторопласта (тефлона) используют для анализа коррозионно-активных веществ и при выполнении анализов на содержание малых примесей высокополярных соединений (вода, аммиак и т. п.) при температуре более 90−100С.

Стеклянные колонки (пирексовские) используют при анализе полярных соединений. Достоинством колонки является возможность визуального наблюдения за состоянием насадки как в процессе набивки, так и в процессе анализа. Недостатком является хрупкость. Эффективность этих колонок зависит от размеров зерен насадки, от способа нанесения НЖФ на твердый носитель и от тщательности набивки трубки сорбентом.

8.2 Микронасадочные колонки отличаются от насадочных только длинной и внутренним диаметром трубок

8.3 Капиллярные колонки

Капиллярные колонки имеют неподвижную фазу, твердую либо жидкую, нанесенную в виде тонкого слоя (толщиной максимум несколько мкм)

на внутреннюю стенку капилляра, остальное пространство остается полой. Поток газа движется по такой колонке с большой линейной скоростью, не встречая значительного сопротивления. Несмотря набольшую длину, для обеспечения необходимых расходов газа-носителя через капиллярную колонку оказывается достаточным примерно такое же входное давление, что и при работе с насадочными колонками. Капиллярные колонки изготавливают из нержавеющей стали, меди, стекла или кварца и применяют в тех случаях, когда насадочные колонки не позволяют достаточно хорошо разделять компоненты, либо когда для хорошего разделения требуется слишком длительное время.

Наиболее широкое распространение получили капилляры из стекла, позволяющие анализировать термически и каталитически неустойчивые, а также высокомолекулярные соединения. Стекла (натрий кальциевые, боросиликатные) наиболее дешевы и доступны, к тому же инертнее и стабильнее, чем металлические.

Газ-носитель

Выбор газа-носителя зависит, главным образом, от нагрузки неподвижной жидкой фазы, она же определяет оптимальный диапазон скоростей газов. Легкие газы-носители (водород, гелий) лучше применять для колонок с малым содержанием НЖФ, которые работают с высокими скоростями потока для быстрых аналитических разделений. Тяжелые газы-носители (азот, аргон) наиболее пригодны для колонок с высоким содержанием НЖФ, которые работают с оптимальной скоростью потока в препаративном режиме.

9. СТАНДАРТНЫЕ ДЕТЕКТОРНЫЕ СИСТЕМЫ

Детектор - устройство, предназначенное для обнаружения в потоке газа-носителя анализируемых веществ по какому-либо физико - химическому свойству. Отклик осуществляется за счет преобразования свойств в электрический сигнал.

Существует множество различных детекторов. Одни детекторы универсальны (детектор по теплопроводности и пламенно-ионизационный детектор) другие селективны к определенному классу органических соединений (детектор захвата электронов, термоионный детектор и т. д.)

9.1 Характеристики детекторов

Исходя из цели анализа и условий его проведения, следует выбирать такой детектор,

характеристики которого соответствуют им в наибольшей степени. Критерии оценки

детекторов общеприняты для всех систем детектирования; к ним относятся:

− чувствительность;

− минимально детектируемая концентрация (предел обнаружения)

− фоновый сигнал;

− уровень шума;

− скорость дрейфа нулевой линии;

− диапазон линейности детектора;

− эффективный объем и время отклика (быстродействие);

− селективность.

10. Методы расчета

Известны четыре основных метода расчета состава смеси по хроматограммам:

метод абсолютной калибровки, метод внутренней нормализ ции, метод внутреннего стандарта и метод стандартной добавки. В методе абсолютной калибровки величина пробы измеряется непосредственно, а в других методах выражается или через суммарную площадь всех пиков (метод внутренней нормализации), через площадь пика постороннего компонента (метод внутреннего стандарта) или через площадь пика компонента сравнения (метод стандартной добавки).

Классификация средств защиты растений

Средства защиты растений делятся на химические средства защиты и биологические. Химические средства защиты растений называют пестицидами.
Все средства защиты растений классифицируются по химическому составу, объектам использования, по характеру действия и способам проникновения во вредный организм.

По химическому составу их делят на 3 основные группы

неорганические соединения (соединения ртути, меди, серы, фтора, бария, бора, мышьяка и т. д.) органические соединения (хлорорганические, фосфорорганические, синтетические пиретроиды, нитрофенолы, производные тио - и дитиокарбаминовой кислот и т. д.); биогенного происхождения, созданные из продуктов жизнедеятельности или самих бактерий, вирусов, грибов, растений (пиретрины, антибиотики).

По объектам использования:

инсектициды — для борбы с вредными насекомыми; акарициды — против клещей;нематициды — против нематод; родентициды — против грызунов;фунгициды (антисептики) — против грибов; антибиотики (антисептики, бактерициды) — против бактерий; гербициды — средства борьбы с сорной флорой; арборициды — против сорной древесной растительности.

По характеру действия пестициды делят на

контактные (убивающие вредный объект при контакте с ним) системные (проникающие в ткани и проводящую систему растений и убивающие вредный объект при питании на таком растении).

По способу проникновения существуют препараты

контактного действия (через покровы тела), кишечного действия (при проглатывании) фумиганты (при дыхании).

По гигиенической группировке пестициды делят на 4 группы:

сильнодействующие ядовитые вещества со среднелетальной дозой (ЛД50) до 1 мг/кг массы тела; высокотоксичные — ЛД50 от 50 до 200 мг/кг;среднетоксичные — ЛД50 от 200 до 1000 мг/кг; малотоксичные — ЛД50 более 1000 мг/кг.

Важно отметить, что по этой группировке любое вещество, не попавшее в первые 3 группы, относится к четвертой.

Средств защиты растений производятся в разнообразных препаративных формах:

дусты (Д) — порошки тонкого размола для опыливания или сухого протравливания, к примеру, табачная пыль; смачивающиеся порошки (СП) — такие препараты при разбавлении водой дают устойчивые суспензии;гранулированные препараты (Г) — для протравливания почвы; растворы (Р);концентраты эмульсий (КЭ), дающие устойчивые эмульсии при растворении водой и многие другие, препаративная форма всегда указывается на упаковке препарата.

Лабораторная работа №12

Определение ХОП  газохроматографическим  методом.

Цель работы: Ознакомиться с  газохроматографическим  методом  анализа. Применить метод для определения содержания остаточных количеств хлорорганических пестицидов  в овощах.

Задачи работы:

- ознакомиться с газохроматографическим  методом  анализа.

- ознакомиться с классификацией  ядохимикатов;

- овладеть методикой определения ХОП;

- определить содержание ДДТ в растениеводческой продукции.

1. Сущность метода состоит в извлечении пестицидов из анализируемого материала этилацетатом, очистке экстракта  с последующим анализом хлорорганических пестицидов на газовом хроматографе с детектором захвата электронов.

2. Экспериментальная часть

Из объединенной пробы продукта отбирают навеску массой 50г, помещают в коническую колбу с притертой пробкой вместимостью 250см3 и заливают 100 см3 этилацетата. Содержимое колбы перемешивают в течение 20 мин.  Экстракт декантируют в колбу, пропускаю через безводный сернокислый натрий. Эту операцию повторяют дважды. Экстракт выпаривают на водяной бане при температуре 40-45оС.

К сухому остатку добавляют 5 см3 гексана,  перемешивают, выпаривают при температуре 40-450С.  Сухой остаток растворяют, внося 10 см3  гексана,

3. Условия хроматографирования

5 мкдм3 гексанового раствора вводят в испаритель газового хроматографа и анализируют в условиях:

Длина колонки- 

Температура колонки-

Температура испарителя -

Температура детектора -

Время удерживания пестицидов-

4. Приготовление градуировочных растворов:

В пробирках вместимостью 5 см3 с пробками на шлифах готовят шкалу градуировочных растворов.

Характеристика раствора	Номер градуировочного раствора
1	2	3
Объем раствора (01мкг/ см3)	0,5	1	3
Объем гексана см3	4,5	4	2
Массовая концентрация пестицида в полученном растворе мкг/ см3	0,01	0,02	0,06
Масса пестицида в 5 мкл хроматографируемой пробы нг (10-3 мкг)	0,05	0,1	0,3
Площадь пика

5. Обработка результатов.

Содержание пестицидов в овощах мг/кг вычисляют в соответствии с градуировочным графиком по формуле:

Х=  mm*v-*v 

m1 – масса пестицида, найденная по графику, мкг

m2- масса анализируемой прбы, г

V1- общий объем раствора, из которого взята аликвота

V2-объем аликвоты, вводимой в хроматограф

6. Контрольные вопросы и задания

-Какие основные виды хроматографии существуют?

- Как устроен газовый хроматограф?

- Какие колонки используют в газовой хроматографии?

-Какие основные типы детекторов у газовых хроматографов?

- По каким признакам классифицируются ядохимикаты?

- Почему при определении ХОП применяют детектор по захвату электронов?

Рекомендуемая литература: Основная

1. , Руководство к лабораторным занятиям по общей гигиене / , , . – М.: Медицина. – 1980-239с.

2. Современные методы анализа и оборудование в санитарно-гигиенических исследованиях. Научно-практическое руководство. Под редакцией член-корр. РАМН, д. м.н., проф. и Д. М.Н., проф. Шестопалова.-М.: ФГУП «Интерсен»,1999,с. 496

-3. ГОСТ 30349-96 Плоды, овощи и продукты их переработки. Методы определения остаточных количеств хлорорганических пестицидов

Дополнительная

1. , Королик к лабораторным занятиям по гигиене и основам экологии человека. — М., 2006. — 512 с.

2. , , Зеленина пособие к лабораторно-практическим занятиям по общей гигиене. Часть 1 / Под ред. Проф. . – Оренбург, 2009 г.

3. , , Зеленина пособие к лабораторно-практическим занятиям по общей гигиене. Часть II Санитарно-химические методы исследования окружающей среды /Под ред. Проф. . – Оренбург, 2010 г.

4. , , Зеленина проб для гигиенических исследований. Учебное пособие. / Под редакцией проф. - Оренбург, 2013. - 109с.

Хронокарта занятия.

№ п/п	Этапы и содержание занятия	Используемые методы (в т. ч., интерактивные)	Время
1 1.1 1.2 1.3	Организационный момент. Контроль посещаемости, дисциплина, успеваемость и т. д. Объявление темы, цели занятия. Краткая характеристика этапов и содержания работы студентов на занятии.	5 5 5
2 2.1 2.2	Входной контроль знаний, умений и навыков студентов Обсуждение возникших у студентов при самоподготовке вопросов Входной  контроль знаний (терминологический диктант)	Объяснение Письменная работа	5 10
3 3.1 3.2	Отработка практических умений и навыков Разбор теоретического материала Самостоятельная практическая работа студентов	Фронтальный опрос Производственно-трудовые упражнения	65 65
4 4.1 4.2 4.3	Заключительная часть занятия: Обобщение, выводы по теме. Контроль качества формируемых компетенций (их элементов) студентов по теме занятия – проверка протокола практической работы Домашнее задание	Объяснение Проверка практической работы	3 15 2

8. Форма организации занятия – практическое занятие.

9. Средства обучения:

- дидактические (таблицы, схемы, раздаточный материал - нормативные документы).- материально - технические (мел, доска)