Использование метода исследования функциональной активности тромбоцитов у детей с геморрагическим синдромом.
1*, 1, 1,2,3,4
1ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России
2ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России
3Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН
4ФГБУ ВО «Московский государственный университет имени », Физический факультет
Резюме. Статья посвящена описанию нового метода изучения функциональной активности тромбоцитов. Описаны параметры, определяемые данным методом. Приведены примеры диагностики геморрагических состояний у детей с использованием этого метода на базе ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева.
В настоящее время вопрос об истинной распространенности нарушений системы гемостаза у детей, в частности тромбоцитопатий, становится все актуальнее. Данные медицинской статистики не отражают объективной картины, поскольку зачастую больные не обращаются в профильные медицинские учреждения, не придавая серьезного значения незначительным эпизодам кровоточивости, либо врачами на местах не устанавливается правильный диагноз, что часто бывает на ранних стадиях и в случаях легкого течения заболевания.
Тромбоцитопатии (ТП) - группа заболеваний, сопровождающихся нарушением функциональной активности тромбоцитов при их нормальном или субнормальном количестве. Чаще всего они проявляются в виде геморрагического синдрома на коже и/или слизистых. К тромбоцитопатиям относятся все формы нарушений гемостаза, при которых в процессе клинического обследования определяются стабильные (в случае наследственно обусловленной патологии - генетически обусловленные) нарушения тромбоцитов функционального, морфологического и биохимического характера. При наследственных ТП — это врожденный дефект, при приобретенных — функциональные свойства тромбоцитов страдают вследствие основного заболевания. Наследственные тромбоцитопатии являются наиболее распространенным генетически обусловленным дефектом гемостаза, выявляемым у 60-80 % детей с рецидивирующей кровоточивостью сосудисто-тромбоцитарного типа. По данным различных авторов, от 36 до 65% всех (наследственных и вторичных) кровотечений у детей связаны с ТП. Тромбоцитопатии в 72,6% случаев являются причиной «спонтанных» носовых кровотечений и в 12% ювенильных «дисфункциональных» маточных кровотечений [1]. Причем наследственные ТП чаще регистрируются у детей с легкой степенью кровоточивости, у детей с тяжелой пурпурой — нередко сочетанные нарушения гемостаза. При ТП отклонений в общем анализе крови может не определяться. Однако при изменении размеров тромбоцитов автоматический анализатор может не зафиксировать фактическое их количество, поэтому важно проводить подсчет с последующей окраской мазков крови по Романовскому-Гимзе. Морфологический анализ тромбоцитов позволяет получить дополнительную информацию о количестве и размерах тромбоцитов, наличия их конгломератов и другие особенности: отсутствие альфа-гранул в крупных серых тромбоцитах указывает на болезнь серых тромбоцитов, при включениях в лейкоциты – болезни, обусловленные мутацией гена MYH9, аномалии морфологии эритроцитов могут свидетельствовать о болезнях, связанных с мутацией гена GATA-1 и др.
Для диагностики и дифференциальной диагностики тромбоцитопатий применяют различные методы исследования агрегационной функции тромбоцитов, а также оценки состояния плазменного звена гемостаза: тромбиновое время − ТВ, международное нормализованное отношение - МНО, активированное частичное тромбопластиновое время – АЧТВ, концентрация фибриногена и др. [2]. Все они могут предоставить информацию только о глобальных изменениях в процессе гемостаза. Золотым стандартом диагностики ТП в настоящее время считается определение агрегационной функции тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазме. В качестве агонистов – активаторов агрегации, чаще всего применяют АДФ, адреналин, коллаген, арахидоновую кислоту и ристоцетин. Этот метод способен выявить лишь общие нарушения агрегационной функции тромбоцитов. Другим существенным недостатком этого метода является то, что на его результаты оказывает заметное влияние число тромбоцитов. При тромбоцитопениях менее 80-100х109/л агрегационную функцию тромбоцитов с помощью этой методики исследовать крайне сложно [3]. Например, диагностические трудности возникают при дифференциальной диагностике псевдо-болезни Виллебранда и болезни Бернара-Сулье, поскольку варианты нарушений при исследовании агрегационной функции тромбоцитов при этих состояниях очень похожи. Также известно, что, например, показатели агрегометрии при синдроме серых тромбоцитов крайне вариабельны у различных пациентов, причем примерно у половины хорошо обследованных индивидуумов показатели агрегации оказываются нормальными или незначительно сниженными [4].
В связи с этим существует острая необходимость в изучении функционального состояния тромбоцитов для дифференциальной диагностики ТП. В настоящее время для этого разработаны разнообразные методики, основанные на детекции специфических антител, меченых флюорофорами, связывающимися с поверхностными антигенами тромбоцитов, варьирующиеся по способам обработки тромбоцитов до анализа, набору детектируемых параметров и способам активации [5].
В лаборатории клеточного гемостаза и тромбоза ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева, Москва, создана универсальная методика определения функциональной активности тромбоцитов (ФАТ), позволяющая определить активность поверхностных интегринов (способность к адгезии), гликопротеинов (способность к агрегации), альфа – и плотных гранул (выход белков и низкомолекулярных веществ, способствующих образованию тромба) тромбоцитов в цельной крови. В качестве активаторов тромбоцитов используются пептидные аналоги коллагена (CRP) и тромбина (TRAP6). Проводится анализ следующих показателей на покоящихся и активированных тромбоцитах:
Тромбоцитарный гликопротеин 1.
Гликопротеин 1 (CD42B, CD42ba) является одной из субъединиц тромбоцитарного рецептора фактора фон Виллебранда. Взаимодействие рецептора с данным белком приводит к первоначально адгезии тромбоцитов на васкулярном суб-эндотелии, а также к активации тромбоцитов. Генетические дефекты, соответствующие дисфункциональным варианта белка приводят к синдрому Бернара-Сулье и болезни фон Виллебранда.
Гликопротеин IIb/IIIa (интегрин бIIbв3).
Это мембранный белок, димерный интегрин, состоящий из альфа цепи бIIb и бета цепи в3. Играет важную роль в агрегации тромбоцитов, мишень антитромботических препаратов. Гликопротеин IIb/IIIa находится на поверхности тромбоцитов и является рецептором фибриногена. Образование комплекса между альфа и бета интегринами представляет собой кальций-зависимый процесс, это необходимый этап в агрегации тромбоцитов и их адгезии к эндотелию. Нарушения гликопротеина IIb/IIIa приводят к тромбастении Гланцмана. Болезнь Гланцмана является наследственным заболеванием с аутосомно-рецессивным характером проявления, характеризуется нарушением гемостаза с тяжелыми рецидивирующими кровотечениями слизистых покровов. Тромбоциты таких больных не связываются с фибриногеном и не способны агрегировать. В случае аутоиммунного нарушения с выработкой аутоантител против гликопротеина IIb/IIIa развивается хроническая иммунная тромбоцитопеническая пурпура.
P-селектин (CD62P).
Белок клеточной поверхности, относится к классу молекул клеточной адгезии, один из трёх селектинов. P-селектин находится в альфа-гранулах тромбоцитов. При активации P-селектин способен быстро экзотицироваться из клетки на поверхность. Его снижение при активации является маркером дефицита альфа-гранул (синдрома серых тромбоцитов). Кроме него в альфа-гранулах содержатся фактор 4 тромбоцитов, тромбоспондин, фибронектин, тромбоцитарный фибриноген, тромбоцитарный фактор Виллебранда, факторы роста и другие белки.
Плотные гранулы.
В плотных гранулах накапливаются и хранятся АДФ (неметаболический пул), серотонин, адреналин, норадреналин и ионы кальция. Кальций участвует в регуляции адгезии, сокращении, секреции, активации фосфолипаз и других жизненно-важных процессах тромбоцита. АДФ секретируется в больших количествах при адгезии тромбоцита к стенке сосуда и способствует прикреплению циркулирующих тромбоцитов к адгезированным, тем самым поддерживая рост тромбоцитарного агрегата. Серотонин, высвобождаясь из плотных гранул, обеспечивает вазоконстрикцию на месте повреждения сосуда. Для определения функционирования плотных гранул используется флуоресцирующее вещество мепакрин, который избирательно захватывается при инкубации тромбоцитов в средс добавлением этого вещества. При уменьшении захвата мепакрина можно говорить либо о недостаточном количестве плотных гранул, либо о нарушениях внутриклеточного транспорта. Недостаточный выход мепакрина при активации свидетельствует о нарушении выхода содержимого плотных гранул. Для определения их функциональной активности был введен индекс активации, отражающий данный параметр. Снижение активности работы плотных гранул свидетельствует о наличии тромбоцитопатии по типу недостаточности пула хранения.
Уникальность данной методики заключается в возможности сравнения экспрессии основных функциональных элементов тромбоцитов в покое и в активированном состоянии. Исследование включает в себя как традиционное иммунофенотипирование поверхностных антигенов тромбоцитов, так и анализ содержимого гранул в обоих состояниях. Этот подход позволяет выявить не только грубые дефекты тромбоцитов, например отсутствие гликопротеина 1, что наблюдается при синдроме Бернара-Сулье, но и такие нарушения, как дефициты пула хранения в различных типах тромбоцитарных гранул, снижение экспозиции прокоагулянтной поверхности, изменение формирования активных комплексов интегринов бIIbв3 (и, таким образом, дифференцировать различные типы тромбастении Гланцмана) и др. Анализ проводится в минимальном объеме цельной крови (20 мкл), что особенно важно при работе с детьми. Отсутствие многоступенчатой пробоподготовки позволяет оценивать исследуемые параметры в условиях, максимально приближенных к физиологическим.
В качестве примера практического применения метода исследования ФАТ у детей мы бы хотели представить описание серии клинических случаев. Нами обследовано 8 пациентов, у которых по результатам проведенного анализа не было получено достоверных данных за тромбоцитопению, коагулопатию, а также вторичную тромбоцитопатию на фоне течения сопутствующей патологии (онкологическое заболевание, сосудистая патология, гепатолиенальный синдром). В качестве коагулологического скрининга были проведены следующие исследования: определение активированного парциального тромбопластинового времени, протромбинового времени, тромбинового времени, фибриногена по Квику, а также активности фактора Виллебранда и XIII фактора свертывания. Данные параметры были исследованы на коагулометре ACL TOP 700 CTS (Instrumentation Laboratory, Werfen) с использованием свежей бедной тромбоцитами плазмы, полученной после центрифугирования цельной крови (2000G, 15 мин). Забор крови осуществлялся посредством пункции локтевой вены. Были использованы стандартные пробирки (S-Monovette 4,3 мл) содержащие 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 1:10.
За тяжелую степень проявлений геморрагического синдрома мы принимали все случаи, когда повышенная кровоточивость приводила к необходимости экстренной госпитализации/введения концентратов факторов свертывания или компонентов крови/проведения хирургического вмешательства или напрямую угрожала жизни пациента. За среднетяжелую кровоточивость мы принимали все случаи повышенной кровоточивости, которые требовали госпитализации и введения гемостатических средств, отличных от перечисленных выше, или приводящие к хронической постгеморрагической анемии средней степени тяжести или легкой острой постгеморрагической анемии. Степень тяжести геморрагических проявлений расценивалась как легкая в тех случаях, когда кровоточивость требовала внимания медицинского персонала в рамках амбулаторной помощи или приводила к легкой хронической постгеморрагической анемии.
Информация о локализации и степени тяжести геморрагического синдрома, а также возрасте дебюта представлена в таблице 1.
Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов.
Пациент | Пол | Возраст | Возраст дебюта | Характеристика геморрагического синдрома | Тяжесть клинических проявлений |
С. В. | Ж | 12 лет 9 мес. | 12 лет | СРНК, КГС, ПМ | Легкая |
М. П. | М | 1 год 1 мес. | 2 мес. | РСГ, КГС, ДК, | Тяжелая |
А. К. | М | 3 года 7 мес. | 1 год 7 мес. | РОФК | Тяжелая |
Б. Н. | Ж | 5 лет 8 мес. | 3 года | СРНК, ДК | Среднетяжелая |
Н. А. | Ж | 15 лет | 11 лет | ПМ, ПОК, ЖКК, КР, ДК | Среднетяжелая |
Л. А. | Ж | 5 лет 3 мес. | 3 года 6 мес. | КГС | Легкая |
С. С. | Ж | 13 лет | 6 лет | КГС | Среднетяжелая |
К. А. | Ж | 7 лет | 1 год | СРНК | Среднетяжелая |
СРНК – спонтанные рецидивирующие носовые кровотечения, КГС – кожный геморрагический синдром, ПМ – полименорея, ДК – десневые кровотечения, ЗСГ – рецидивирующие субдуральные гематомы, РОФК – рецидивирующие орофарингеальные кровотечения, ПОК – послеоперационные кровотечения, ЖКК – желудочно-кишечное кровотечение, КР – кровотечения из ран.
Таким образом, большинство геморрагических эпизодов характеризовались как среднетяжелые, в то время как тяжелые проявления кровоточивости наблюдались у 25% пациентов. Наиболее часто пациентов беспокоил кожный геморрагический синдром. Средняя длительность постановки диагноза относительно возраста первых клинических проявлений составила 3,15 ± 2,32 лет.
Как видно из табл. 2, после проведения стандартного иммунофенотипирования тромбоцитов один или более дефектов были выявлены у 7 детей.
Таблица 2. Результаты применения метода ФАТ у детей
Пациент | Иммунофенотипирование | ФАТ |
С. В. | CD42b N CD61 N PAC1 N Mepacrine ↓ CD62p ↑ | CD42b N CD61 N PAC1 N Mepacrine ↓ (индекс активации ↓) CD62p ↓ |
М. П. | CD42b ↑ CD61 N PAC1 N Mepacrine N CD62p ↑ | CD42b ↑ CD61 ↑ PAC1 ↑ Mepacrine ↓ (индекс активации ↓) CD62p N |
А. К. | CD42b N CD61 ↑ PAC1 N Mepacrine ↓ CD62p N | CD42b ↑ CD61 ↑ PAC1 N Mepacrine ↓ (индекс активации ↓) CD62p N |
Б. Н. | CD42b ↑ CD61 N PAC1 N Mepacrine ↓ CD62p N | CD42b ↑ CD61 ↑ PAC1 ↑ Mepacrine ↑ (индекс активации ↓) CD62p N |
Н. А. | CD42b ↑ CD61 N PAC1 ↓ Mepacrine N CD62p ↓ | CD42b N CD61 ↑ PAC1 ↑ Mepacrine ↓ (индекс активации N) CD62p N |
Л. А. | CD42b N CD61↑ PAC1↓ Mepacrine ↓ CD62p ↑ | CD42b N CD61 ↑ PAC1 ↑ Mepacrine N (индекс активации ↓) CD62p N |
С. С. | CD42b N CD61 N PAC1 N Mepacrine N CD62pN | CD42b N CD61 N PAC1 ↑ Mepacrine N CD62p N |
К. А. | CD42b ↑ CD61 N PAC1 ↓ Mepacrine N CD62p N | CD42b N CD61 N PAC1N Mepacrine N (индекс активации N) CD62p N |
При исследовании показателей функциональной активности тромбоцитов без активации изолированное нарушение захвата мепакрина обнаружено у 4 детей, пониженная экспрессия активного комплекса интегрина бIIbв3 (РАС1) – у 3, комбинированные нарушения – у 7 пациентов.
После активации тромбоцитов у 4 детей с дефектом захвата мепакрина было установлено снижение индекса активации, что свидетельствует о недостаточности пула хранения плотных гранул.
У 1 пациента с нормальным показателем захвата мепакрина выявлена недостаточность его выхода, что свидетельствует о нарушении дегрануляции плотных гранул. У него же было выявлено повышение CD42b и CD62p до активации, а после нее было показано также повышение экспресии как суммарной, так и активной фракции интегрина бIIbв3. Это в целом свидетельствует о состоянии предактивации тромбоцитов. У 2 пациентов было выявлено состояние предактивации, сопровождающееся дефицитом пула хранения плотных гранул. Еще у двух – дисбаланс в формировании активного комплекса интегрина бIIbв3. У 1 пациентки без первоначально выявленных дефектов, в ответ на стимуляцию было отмечено увеличенное формирование комплексов активного интегрина. Также у 1 пациента было отмечено увеличение количества гликопротеина 1 на поверхности тромбоцитов в сочетании с недостаточным количеством активного интегрина, однако после активации все показатели нормализовались. Вероятнее всего это является индивидуальной особенностью данного пациента и не влияет на функциональный ответ тромбоцтов.
Таким образом, при проведении стандартного иммунофенотипирования тромбоцитов, из 8 детей с геморрагическим синдромом, не связанным с наличием геморрагической коагулопатии, тромбоцитопении или сопутствующей патологии, которая может приводить к нарушению функции тромбоцитов, те или иные нарушения были выявлены у всех 8 детей. Проведение активации тромбоцитов позволило исключить первоначально выявленные нарушения у 1 (12,5%) пациента, в то время как у 7 (87,5%) детей были обнаружены дополнительные функциональные дефекты, позволившие уточнить особенности нарушений.
В настоящий момент в нашей стране нет единого подхода к диагностике тромбоцитопатий. Нигде не проводятся комплексные исследования, включающие в себя изучение корреляций между следующими показателями: состояние плазменного звена гемостаза, вклад тромбоцитов и их функциональной активности при различных типах активации, морфологических особенностях тромбоцитов и генетических данных о наличии специфических мутаций. Внедрение исследования функциональной активности тромбоцитов в рутинную практику будет иметь важнейшее значение для диагностики нарушений гемостаза у детей.
Список литературы:
V. Laosombat et al, Acquired platelet dysfunction with eosinophilia in children in the south of Thailand, Platelets. 2001. - Feb. - Vol. 12. - №1. - P. 5-14 Platelet function tests: a comparative review. Paniccia R, Priora R, Alessandrello Liotta A, Abbate R. Vasc Health Risk Manag. 2015 P. Harrison, Platelet function analysis, Blood Reviews (2005) 19, 111–123 M. Gunay-Aygun et al., Gray platelet syndrome: natural history of a large patient cohort and locus assignment to chromosome 3p, Blood, 2010 116: 4990-5001 Cytofluorimetric platelet analysis. Carubbi C, Masselli E, Gesi M, Galli D, Mirandola P, Vitale M, Gobbi G Semin Thromb Hemost. 2014 Feb; 40(1):88-98