Получение наночастиц магнетита и их комплексов с липосомами для биомедицинского применения (стр. 3 )

3.3. Метод динамического рассеивания света (ДРС)

Данный метод позволяет получить данные о распределении по размерам частиц в растворе. Для этого свет определенной частоты (обычно лазер) направляют на раствор. При достижении светом частицы, он отражается и рассеивается, т. к. ее размер сравним с длиной волны. Поскольку частицы в растворе находятся в Броуновском движении, источники рассеивания все время перемещаются. Соответственно, флуктуация локальной концентрации частиц соответствует флуктуации интенсивности рассеянного света. Метод помогает определить коэффициент диффузии дисперсных частиц в жидкости, из которого потом рассчитывается радиус наночастиц по формуле Стокса-Эйнштейна (2),

  (2)

где — коэффициент диффузии, — постоянная Больцмана,
— абсолютная температура, — вязкость жидкости, — радиус частицы.

Также метод ДРС используется в качестве показателя стабильности липосом. Поскольку, как упоминалось выше, данные частицы имеют со временем склонность к агрегации, можно заметить увеличение количества больших частиц в растворе [23].

3.4. Анализ траектории наночастиц (АТН)

Данный способ часто используется для измерения концентрации наночастиц в растворе и их распределения по размерам. Для этого раствор облучают лазером, при этом частицы, размером менее длины волны, ведут себя как точечные рассеиватели света. Наблюдение производится через ультрамикроскоп, расположенный сверху, под прямым углом к лазеру. Высокочувствительная камера записывает видео Броуновского движения частиц. Далее компьютер, исходя из известного объема области наблюдения и количества зафиксированных частиц, рассчитывает концентрацию раствора (рис.10) [24].

Рис. 10.  Схема строения прибора для анализа траектории частиц.

       Как и в методе динамического светорассеяния, гидравлический радиус наночастицы вычисляется по уравнению Стокса-Эйнштейна.

Итак, целью данной работы является синтез наночастиц магнетита различной формы и с различными покрытиями и получение комплексов этих наночастиц с липосомами. Для достижения поставленной цели должны быть решены следующие задачи:

Синтезировать наночастицы магнетита в форме сфер и палочек, стабилизированные различными лигандами (золотом с меркаптоундекановой кислотой, золотом с липоевой кислотой, дофамином), и охарактеризовать их методами просвечивающей электронной микроскопии, динамического светорассеивания, анализа траектории наночастиц и рентгенофазового анализа. Получить комплексы наночастиц с липосомами и охарактеризовать их методом динамического светорассеяния.

Экспериментальная часть

Материалы и методы

Реагенты: четырехводный хлорид железа (II) (FeCl2∙4H2O, 98%), безводный хлорид железа (III) (FeCl3, 98%), гидрат цитрата натрия (Na3C6H5O7∙5.5H2O), водный раствор пероксида водорода (H2O2, 36%),  водный раствор аммиака (NH3, 30%), раствор хлорной кислоты (HClO4, 70%), тригидратзолотохлористоводородной кислоты (HAuCl4∙3H2O, 99.9%), концентрированная соляная кислота (HCl, 37%), липоевая кислота (С8H14O2S2 о. с.ч.), 11-меркаптоундекановая кислота (SH-C10H20-COOH о. с.ч.) – все Sigma-Aldrich, USA.

Микрофотографии образцов были получены на просвечивающем электронном микроскопе LEO 912 AB OMEGA (Carl Zeiss, Германия) с рабочим ускоряющим напряжением 100 кВ, а так же на просвечивающем электронном микроскопе JEOL JEM-2100F/Cs/GIF (200 kV, 0.8 A). Тѐмнопольные изображения и карты распределения элементов по данным EDX, были получены в режиме STEM (детекторы HAADF и JED 2300 (JEOL)), размер фокусного пятна составлял 1 нм. Образцы готовились нанесением 1-2 мкл раствора на покрытую формваром медную сетку (d = 3.05 мм), которая затем сушилась на воздухе (1 мин).

Анализ траекторий наночастиц проводили на приборе NanoSight NS500. Время записи видео составляло не менее 60 секунд (внутренние параметры камеры: shutter 1000, gain 400), для каждого образца делалось не менее 3 повторений (с прокачиванием новой части раствора под объектив камеры). Для обработки видео использовался программный пакет NTA Analytical Software (версия 2.3), предел определения (detection threshold) выбирался равным 5.

Методом динамического светорассеяния на приборе Zetasizer Nano ZS (угол 173°) с применением He-Ne лазера (633 нм, 5 мВ) проводилось исследование распределения частиц по размерам. Для каждого образца проводилось не менее 3-х экспериментов с 10 измерениями в каждом.

Рентгенофазовый анализ образцов проводился на дифрактометре ДРОН-4 (CoKб излучение с л = 0,179 нм, напряжение трубки 40 кВ, ток 30 мА) в диапазоне дифракци-онных углов 2и от 20° до 120° с шагом 0,1°; время экспозиции на точку съёмки 3 с.
Качественный фазовый анализ проводили путём сопоставления спектров с использованием базы данных по рентгеновским спектрам фаз (программа PHAN, около 200000 фаз). Количественный фазовый анализ (включая оценку размеров кристаллитов по ОКР) проводили с помощью программ PHAN% и SPECTRUM, разработанных на кафедре физического материаловедения НИТУ "МИСиС" [25]. Данная методика представляет собой модификацию метода Ритвельда, основанного на минимизации разницы между снятым по точкам экспериментальным и модельным (расчётным) спектрами.

Получение сферических наночастиц магнетита.

Синтез наночастиц магнетита: 130 мг FeCl3 (4·10-3 моль) и 78,4 мг FeCl2∙4H2O (2·10-3 моль) растворили в 1 мл 2М HCl, полученный раствор медленно прикапывали (в течение 1 минуты) к 10 мл 0,7М раствора NH3 в деионизованной H2O (V(28% NH3)=0,47 мл), смесь перемешивали 30 минут, затем образовавшийся магнетит отделили от раствора при помощи магнита, промывали 10 мл 2M HClO4 (V(70% HClO4)=2.56 мл). После промывки магнетит опять отделили при помощи магнита и растворили  в 10 мл деионизованной H2O при помощи ультразвуковой бани (30 мин).

Покрытие наночастиц магнетита золотой оболочкой: В круглодонной колбе растворили 35 мг HAuCl4∙3H2O (0,088 ммоль) в 120 мл деионизованной H2O, довели раствор до кипения, затем прибавили 5 мл раствора НЧ магнетита (2·10-4 моль),  кипятили при перемешивании 10 минут, затем быстро добавили 5 мл раствора цитрата натрия (0,08M, m(Na3C6H5O7∙2H2O) = 0,1176 г). Затем раствор кипятили 5 минут, в течение которых раствор приобретал красно-вишневый цвет с коричневым оттенком, после чего выключили нагревание, охладили полученный раствор до комнатной температуры и хранили в холодильнике. Полученные НЧ *****@***были стабилизированы цитрат-ионами.

Очистка и функционализация частиц Fe3O4@Au: Провели центрифугирование (7000 оборотов/мин, 5 мин). Раствор с непокрытым магнетитом отделили. Осадок с наночастицами *****@***смешали с 10 мл деионизованной H2O, затем прикапали при перемешивании 10 мл раствора лигандов и оставили перемешивание на 14 часов. Затем провели диализ полученной смеси в деионизованной H2O с использованием мешков для диализа SERVAPOR 44146 MWCO 12-14 kDa (3 раза по 1 литру в течение 3-х дней). Далее оставшуюся во внутреннем объеме пакета смесь декантировали, пропустили через шприцевой фильтр Millipore Hydrophilic HV 0.22 мm. Полученные 18-20 мл суспензии наночастиц хранили в холодильнике.

Получение наночастиц магнетита в форме палочек.

Магнетит цилиндрической формы (палочки) получили частичным восстановлением в условиях микроволнового излучения комплекса железа (III) c дофамином в щелочной среде. Раствор хлорида железа FeCl3 (0.5M) смешали с раствором 0.04 M HCl. 5 мл дофамина (dopa) (3мг/мл) добавили при тщательном перемешивании и оставили на 10 мин при тщательном магнитном перемешивании. Затем 90 мл воды при температуре 80-90OC прилили к перемешивающемуся раствору. Раствор прокипятили в течение 2 часов при тщательном перемешивании. Суспензию охладили до комнатной температуры и довели pH до 7-8 добавлением щелочи (1M KOH). Осадок отделили центрифугированием и промыли деионизованной водой. Полученную желтую коллоидную суспензию (2 мл) смешали с 100 мкл гидразина (водный раствор) и поместили в микроволновую печь (2 цикла по 2 мин 200 W). Продукт отделили центрифугированием.

Получение липосом

Липиды взяли в требуемом весовом соотношении, тщательно удалили органический растворитель на вакуумном роторном испарителе при температуре 55С. Образовавшуюся тонкую пленку липидов диспергировали в 2 мл 0.01М боратного буфера, рН 9.0. Препарат обработали ультразвуком (22 кГц) в течение 600 с (3Ч200с) в непрерывном режиме при постоянном охлаждении на диспергаторе 4710 «Cole-Parmer Instrument» (США). Полученные липосомы использовали в течение суток.

Получение комплексов наночастиц магнетита с липосомами

Получение комплексов липосом с магнитными наночастицами (снаружи): Липиды взяли в требуемом весовом соотношении, тщательно удалили органический растворитель на вакуумном роторном испарителе при температуре 55С. Образовавшуюся тонкую пленку липидов диспергировали в 2 мл 0.01М боратного буфера, рН 9.0. Препарат обработали ультразвуком (22 кГц) в течение 600 с (3*200с) в непрерывном режиме при постоянном охлаждении на диспергаторе 4710 «Cole-Parmer Instrument» (США). Добавили в желаемом соотношении раствор МНЧ.

Основные результаты и их обсуждение

В ходе данной работы были получены наночастицы магнетита в виде двух форм: сферы и палочки.

Первая форма была получена методом соосаждения. Для этого к смеси растворов солей железа (II) и железа (III) добавляли аммиак по реакции (3).

FeCl2 + 2FeCl3 + 8NH3·H2O = Fe3O4↓ + 8NH4Cl + 4H2O (3)

Состав полученной фазы был подтвержден РФА (рис.11).