УТВЕРЖДАЮ
Руководитель
Федеральной службы по
надзору в сфере защиты
прав потребителей и
благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г.ОНИЩЕНКО
17 августа 2006 г.
Дата введения:
с момента утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
КОНТРОЛЬ СЫВОРОТКИ КРОВИ
КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА НА ПРИСУТСТВИЕ
ПОСТОРОННИХ ВИРУСОВ И МИКОПЛАЗМ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.2123-06
1. Разработаны: ФГУН "Государственный научно-исследовательский
институт стандартизации и контроля медицинских биологических
препаратов им. " Роспотребнадзора (,
, ).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному
санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по
надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
(протокол N 2 от 01.01.2001 г.).
3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной
службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия
человека, Главным государственным санитарным врачом Российской
Онищенко 17 августа 2006 г.
4. Введены взамен: "Контроль сыворотки крови крупного рогатого
скота на отсутствие вирусов-контаминантов и микоплазм" РД
42-28-14-88.
1. Область применения
1.1. Методические указания устанавливают методы контроля
коммерческой сыворотки крови крупного рогатого скота (далее -
сыворотка) на присутствие посторонних вирусов и микоплазм.
Сыворотка широко применяется при культивировании органов и тканей
животных, используемых для приготовления профилактических и
диагностических иммунобиологических препаратов и в научных
исследованиях. Сыворотка является одним из компонентов питательных
сред, используемых для культивирования первичных и перевиваемых
клеточных культур.
1.2. Методические указания предназначены для специалистов
органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты
прав потребителей и благополучия человека, выпускающих и
контролирующих медицинские иммунобиологические профилактические
препараты.
1.3. Методические указания также могут использоваться
организациями, зарегистрированными в Российской Федерации,
выпускающими и контролирующими медицинские иммунобиологические
профилактические препараты, и специалистами научных лабораторий.
2. Общие положения
Контроль сыворотки на присутствие посторонних вирусов
предусматривает использование первично-трипсинизированных и
перевиваемых клеточных культур, являющихся высокочувствительными и
доступными для выявления наиболее часто встречающихся
вирусов-контаминантов. В этих культурах хорошо размножаются с
развитием цитопатических изменений вирусы парагриппа,
инфекционного ринотрахеита, диареи и аденовирусы.
Продолжительность контроля 28 сут.
Контроль сыворотки на присутствие микоплазм предусматривает
проведение двух методов:
1. Микробиологический метод. Метод основан на выявлении роста
микоплазм при внесении испытуемой сыворотки в питательные среды.
Продолжительность контроля 21 сут.
2. Метод индикаторной клеточной культуры (цитохимический
метод).
Метод основан на выявлении ДНК микоплазм, окрашенных
флюорохромом Hoechst-33258 на индикаторной клеточной культуре
Vero.
Продолжительность контроля 3-5 сут.
3. Средства измерений, вспомогательные устройства,
оборудование, реактивы и материалы
3.1. При выполнении контроля должны быть применены следующие
средства измерений, оборудование и вспомогательные устройства:
весы аптечные от 1 до 20 г, погрешность
+/- 20 мг ТУ 64-1-2834-80
колбы стеклянные, конические,
вместимостью 50 мл, 100 мл ГОСТ 25336-82Е
стакан химический, вместимостью 1000 мл ГОСТ 25336-82Е
пипетки градуированные от 1,0 до 10,0 мл ГОСТ 29227-91
пробирки бактериологические
вместимостью от 10,0 до 20,0 мл ГОСТ 25336-82Е
стакан химический, вместимостью 1000 мл ГОСТ 25336-82Е
флаконы для культивирования из
нейтрального стекла (матрасы) ГОСТ 5636-70
флаконы, вместимостью 100, 500 мл МРТУ 5031-32
мешалка магнитная МРТУ 64-1-1503-67
микроскоп биологический (любой модели)
микроскоп люминесцентный серии ЛЮМАМ
ножницы медицинские ГОСТ 21239-93
пинцеты анатомические ТУ 64-1-37-78
пробки резиновые ТУ 38.006269-95
стекла предметные ТУ 9464-001-33016370-95
чашки Петри (однократного применения) ТУ 64-2-19-79
воронка стеклянная ГОСТ 25336-82Е
камера Горяева ТУ 9443-001-11856833-94
термостат на температуру 37 град. С
с погрешностью измерения не более
+/- 1 град. С
холодильник с температурой от 4 до
10 град. С, вместимостью 1000 мл
холодильник с температурой минус
(20 +/- 4) град. С
центрифуга ЦЛС-3 МРТУ 42.1778-65 (495)
3.2. При выполнении контроля должны быть применены следующие
реактивы и материалы:
бензилпенициллина натриевая соль ФСП 42-0048-1083-01
стрептомицина сульфат ФС 42-3726-99
версена раствор ФСП 42-0196-3274-02
вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
гидролизат сердца крупного рогатого
скота
дрожжи хлебопекарные прессованные ГОСТ 171-81
глицерин, чда ГОСТ 6259-75
масло иммерсионное кедровое (чистое) ТУ 81-05-79-75
мясная вода ТУ 42.14.271-82
натрия гидроокись ГОСТ 4228-77
натрия хлорид ГОСТ 4233-77
раствор Хенкса ФСП 42-0343-3541-02
спирт этиловый ректификованный
96 град. ГОСТ 18300-87
питательная среда ДМЕМ ФСП 42-0343-3544-02
сыворотка крови крупного рогатого
скота, жидкая для культур клеток
(предварительно отконтролированная
на присутствие посторонних вирусов
и микоплазм) ФСП 42-0196-4672-03
тестикулы эмбрионов быка (получают
на мясокомбинате, срок хранения не
более 1 сут. при температуре от 4
до 10 град. С)
трипсин (0,25%-й раствор) ФСП 42-0343-3805-03
хлороформ ГОСТ 20015-88
бумага фильтровальная ГОСТ 12026-761
вата медицинская гигроскопическая ТУ 8195-01116673801-99
марля медицинская ГОСТ 9412-93,
ТУ 9390-0119-34576906-95
4. Требования безопасности
Работу с микроорганизмами 3 и 4 групп проводят в соответствии
с СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV
групп патогенности и гельминтами".
5. Условия проведения контроля
Подготовительные операции и испытания на присутствие
посторонних вирусов и микоплазм проводят в чистых помещениях
класса А/В (GMP) с ламинарным потоком воздуха при соблюдении
правил асептики, при температуре (20 +/- 2) град. С и
относительной влажности 60-70%.
6. Контроль сыворотки на присутствие посторонних вирусов
При выполнении контроля используют два вида клеточных культур:
первично-трипсинизированные - тестикулы эмбрионов быка (ТБ)
4-6-месячного возраста и перевиваемые - почки быка (МДВК) или
любые другие перевиваемые клеточные культуры почки крупного
рогатого скота, в которые вносят исследуемые сыворотки. Принцип
метода основан на появлении цитопатического действия (ЦПД) или
гемадсорбции под действием вирусов-контаминантов.
6.1. Подготовка к выполнению контроля
При подготовке к выполнению контроля сыворотки на присутствие
посторонних вирусов должны быть выполнены следующие операции:
6.1.1. Приготовление первично-трипсинизированной клеточной
культуры тестикулов эмбрионов быка (ТБ).
6.1.2. Доставляют тестикулы эмбрионов быков 4-6-месячного
возраста с перевязанной мошонкой с мясокомбината в любом
стерильном сосуде с 250-270 мл раствора Хенкса с 500 ед/мл
бензилпенициллина калиевой или натриевой соли.
6.1.3. Обжигают кожу мошонки над пламенем горелки и
обрабатывают тампоном со спиртом.
6.1.4. Срезают ножницами кожу с кончика мошонки и, подтягивая
тестикулы за семенные канатики, извлекают их.
6.1.5. Помещают тестикулы в стерильную чашку Петри и удаляют
ножницами белочную оболочку.
6.1.6. Переносят тестикулы в чашку Петри с 30-35 мл раствора
Хенкса с 100 ед/мл антибиотика.
6.1.7. Разрезают тестикулы вдоль и вылущивают ножницами
содержимое в раствор Хенкса.
6.1.8. Промывают ткань тестикулов до просветления жидкости 2-3
раза в растворе Хенкса с 500 ед/мл антибиотика.
6.1.9. Помещают ткань тестикулов в колбу вместимостью 500 мл с
перемешивающим стержнем, прилагаемым к магнитной мешалке.
6.1.10. Нагревают 0,2%-й раствор трипсина до температуры (20
+/- 2) град. С и наливают 100-150 мл в колбу. Колбу ставят на
магнитную мешалку и включают ее. Скорость вращения перемешивающего
стержня должна быть такой, чтобы жидкость не пенилась и стержень
не ударялся о стенки колбы.
Перемешивание проводят 5-6 мин.
6.1.11. Сливают надосадочную жидкость после первого цикла
трипсинизации в колбу для отходов.
6.1.12. Проводят 4-5 циклов трипсинизации.
6.1.13. Сливают надосадочную жидкость после каждого цикла во
флаконы вместимостью 100 мл.
6.1.14. Помещают флаконы в центрифугу и осаждают клетки при
скорости 1000-1500 об/мин. в течение 10-15 мин.
6.1.15. Вынимают флаконы из центрифуги, сливают надосадочную
жидкость в сосуд для отходов.
6.1.16. Добавляют в каждый флакон к осадку клеток по 10-15 мл
среды 0,5%-го гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса.
6.1.17. Объединяют полученные суспензии клеток в один флакон и
отбирают пипеткой (0,5 +/- 0,01) мл.
6.1.18. Добавляют к 0,5 мл этой суспензии 0,5 мл 0,1%-го
раствора метиленового синего и подсчитывают окрашенные клетки в
х
камере Горяева при увеличении 70. Для точности результатов
подсчет проводят в нескольких пробах. Количество клеток в 1 мл
подсчитывают по формуле:
а х 1000 х 2
Х = ------------ , где
0,9
X - концентрация клеток в 1 мл исходной суспензии;
а - среднее число клеток в нескольких пробах;
0,9 - объем камеры Горяева в куб. мм;
1000 - число куб. мм в 1 куб. см;
2 - коэффициент разведения суспензии добавленным объемом
краски.
6.1.19. Разводят суспензию клеток средой ДМЕМ во флаконе по
5
п. 6.1.17. с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось 4-5 х 10
клеток/мл.
6.1.20. Вносят в каждый из 2 флаконов вместимостью 1000 мл по
100-120 мл разведенной суспензии клеток и добавляют 10% сыворотки,
предварительно отконтролированной на присутствие посторонних
вирусов и микоплазм.
6.2. Культивирование и подготовка перевиваемой
клеточной культуры почки быка (МДВК)
6.2.1. Готовят во флаконе вместимостью 100 мл 50 мл смеси,
состоящей из равных объемов 0,02%-го раствора версена и 0,25%-го
раствора трипсина и нагревают ее до температуры (20 +/- 2) град.
С.
6.2.2. Просматривают флаконы с МДВК вместимостью 1000 мл под
х
микроскопом при увеличении 70 и отбирают с полным монослоем
клеток.
6.2.3. Сливают питательную среду из флаконов в сосуд для
отходов и добавляют смесь версена и трипсина.
6.2.4. Оставляют клетки в смеси версена и трипсина при
температуре (20 +/- 2) град. С и наблюдают за ними визуально.
6.2.5. Когда начнется "набухание" и слабое "отслоение" клеток
от стекла (обычно через 15-20 мин.), сливают смесь версена и
трипсина в сосуд для отходов.
6.2.6. Флаконы с клеточной культурой помещают при температуре
(37 +/- 1) град. С на 30-35 мин.
6.2.7. Добавляют во флаконы по 50 мл среды ДМЕМ и встряхивают
их так, чтобы все клетки отделились от стекла.
6.2.8. Подсчитывают клетки в камере Горяева, как указано в п.
5.1.18.
6.2.9. Разводят клетки средой ДМЕМ с таким расчетом, чтобы в 1
5
мл содержалось 2 х 10 клеток/мл.
6.2.10. Вносят в каждый из 2 флаконов по 100-120 мл
разведенной суспензии клеток и добавляют 10% сыворотки,
предварительно отконтролированной на присутствие посторонних
вирусов и микоплазм.
6.2.11. Через 5-6 сут. просматривают флаконы под световым
микроскопом и отбирают с полным монослоем клеток.
6.3. Выполнение контроля сыворотки на
присутствие посторонних вирусов
При выполнении контроля сыворотки на присутствие посторонних
вирусов должны быть выполнены следующие операции:
6.3.1. Отбирают по 1 флакону с клеточными культурами ТБ и МДВК
для проверки испытуемой сыворотки и по 1 флакону с теми же
культурами в качестве контрольных.
6.3.2. Сливают питательную среду из флаконов в сосуд для
отходов.
6.3.3. Монослой клеток ТБ и МДВК промывают 3 раза средой ДМЕМ
без сыворотки.
6.3.4. Вносят пипеткой в каждый из двух флаконов вместимостью
1000 мл с клеточными культурами ТБ и МДВК по 25 мл испытуемой
сыворотки так, чтобы разведение в среде не превышало 1:4 из
расчета не менее 3 кв. см площади на 1 мл сыворотки.
Одновременно вносят пипеткой в каждый из двух контрольных
флаконов вместимостью 1000 мл с клеточными культурами ТБ и МДВК по
25 мл сыворотки, ранее отконтролированной на присутствие
посторонних вирусов и микоплазм.
6.3.5. Инкубируют клеточные культуры ТБ и МДВК при температуре
(20 +/- 2) град. С (60 +/- 5) мин.
6.3.6. Сливают сыворотку и добавляют в опытные и контрольные
флаконы с культурами ТБ и МДВК по 75 мл среды ДМЕМ.
Инкубируют при температуре (37 +/- 1) град. С 14 сут.
6.3.7. С целью обнаружения цитопатогенного действия (ЦПД)
просматривают опытные и контрольные клеточные культуры под
микроскопом на 2, 5, 7, 10 и 14 сут.
6.3.8. Если в опытных и контрольных клеточных культурах не
будет наблюдаться ЦПД, через 14 сут. их трижды замораживают при
температуре минус (20 +/- 2) град. С и размораживают при
температуре (37 +/- 2) град. С.
6.3.9. После размораживания культуры флаконы встряхивают,
отбирают из каждого флакона с клеточными культурами ТБ и МДВК по
25 мл суспензии и вносят во флаконы с клетками того же вида. Два
флакона с клеточными культурами ТБ и МДВК оставляют для контроля.
6.3.10. Вносят в опытные и контрольные клеточные культуры ТБ и
МДВК по 75 мл среды ДМЕМ.
6.3.11. Клеточные культуры инкубируют при температуре (37 +/-
2) град. С в течение 14 сут.
Если в течение 14 сут. в опытных и контрольных клеточных
культурах не наблюдается ЦПД, их проверяют на наличие
гемадсорбирующих вирусов.
6.3.12. Сливают из флаконов питательную среду и промывают
культуры 3 раза раствором Хенкса.
6.3.13. Добавляют в опытные и контрольные клеточные культуры
по 50 мл 0,25%-й взвеси куриных эритроцитов и эритроцитов морской
свинки и инкубируют их при температуре (37 +/- 2) град. С.
6.3.14. Через 30-35 мин. эритроциты из флаконов удаляют, а
монослой промывают раствором Хенкса и просматривают под
х
микроскопом при увеличении 70 .
6.4. Учет результатов
6.4.1. Если в клеточных культурах при первичной инокуляции
сыворотки и в пассаже не выявлено ЦПД и не отмечено гемадсорбции,
сыворотка признается пригодной.
6.4.2. Если при исследовании наблюдается ЦПД или отмечается
гемадсорбция в испытуемых клеточных культурах при отсутствии в
контроле, сыворотку бракуют.
6.4.3. Если ЦПД или гемадсорбция появились в контрольных и в
опытных клеточных культурах, допускается однократный переконтроль
сыворотки.
7. Контроль сыворотки на присутствие микоплазм
7.1. Микробиологический метод контроля сыворотки
на присутствие микоплазм
Обнаружение микоплазм микробиологическим методом
предусматривает внесение исследуемой сыворотки в бульонную
питательную среду, инкубирование в течение 7 сут. и последующий
высев на питательную среду, содержащую 0,3% агара.
7.2. Чувствительность микробиологического метода
Микробиологический метод контроля сыворотки позволяет
обнаруживать одну и более колоний микоплазм в объеме не более 100
мл сыворотки.
7.3. Приготовление бульонной среды
7.3.1. Для приготовления 1 л среды к 200 мл триптического
гидролизата бычьего сердца (содержание сухих веществ 8-10%)
добавляют 400 мл мясного экстракта 1:2 (содержание сухих веществ
3,0-3,5%), экстракт хлебопекарных дрожжей из расчета 1,5 г сухих
веществ на 1 л среды, и 5,0 г хлорида натрия.
7.3.2. С помощью 10%-го раствора NaOH устанавливают значение
рН бульонной среды от 8,0 до 8,2.
7.3.3. Среду нагревают до кипения, кипятят 2-3 мин., фильтруют
через складчатый бумажный фильтр.
7.3.4. Разливают по 300-305 мл во флаконы, закрытые
ватно-марлевыми или резиновыми пробками и завальцованные
алюминиевыми колпачками, и стерилизуют автоклавированием при
температуре 110 град. С 30 мин. С помощью 5%-го раствора соляной
кислоты устанавливают рН от 7,8 до 8,0.
7.3.5. Для приготовления среды, содержащей 0,3% агара,
дополнительно вносят 3,0 г агара.
Готовые среды хранят при температуре от 2 до 8 град. С не
более 4 мес.
7.4. Стерильность питательной среды
7.4.1. Для испытания на стерильность отбирают не менее 2% от
количества емкостей в серии. Определение проводят путем
визуального просмотра каждого флакона с питательной средой после
выдерживания в течение 44-48 ч при температуре (37 +/- 1) град. С
и 14 сут. при температуре 20-25 град. С.
7.4.2. В случае пророста хотя бы в одном флаконе бракуют всю
серию. Далее питательная среда не используется.
7.5. Определение ростовых свойств среды,
содержащей 0,3% агара
Каждую серию приготовленной среды проверяют на ростовые
свойства, используя тест-штамм Mycoplasma arginini G 230 (ОСО
42-28-378-05).
Среду считают чувствительной и признают годной, если
результаты ее испытания соответствуют Инструкции по применению ОСО
42-28-378-05.
7.6. Подготовка сред для контроля
7.6.1. Перед употреблением полужидкую среду, содержащую 0,3%
агара, разогревают в водяной бане до полного расплавления агара и
охлаждают до температуры 40-45 град. С.
7.6.2. Добавляют 15-20% нормальной сыворотки крови лошади без
консерванта, предварительно проверенной на стерильность и
присутствие микоплазм, и 100 ед/мл бензилпенициллина натриевой
соли.
7.6.3. Разливают по 10 мл в бактериологические пробирки и
закрывают ватно-марлевыми пробками. Хранят среду при температуре
от 2 до 8 град. С не более 7 сут.
7.7. Выполнение контроля сыворотки на присутствие
микоплазм микробиологическим методом
При выполнении контроля сыворотки микробиологическим методом
должны быть выполнены следующие операции:
7.7.1. Вносят (300 +/- 2) мл бульонной среды во флакон
вместимостью 500 мл. Флакон закрывают ватно-марлевой пробкой.
7.7.2. Вносят (100 +/- 2) мл исследуемой сыворотки в (300 +/-
2) мл бульонной среды. Смесь инкубируют 7 сут. при температуре (37
+/- 1) град. С и относительной влажности 80-90%.
7.7.3. Отбирают 10 пробирок со средой, содержащей 0,3% агара,
и вносят в каждую пробирку по (1,0 +/- 0,1) мл смеси исследуемой
сыворотки и бульонной среды. Посев проводят прокалыванием всего
столбика питательной среды, содержащейся в пробирке, концом
пипетки вместимостью 1,0 мл, выпуская равномерно ее содержимое,
начиная от дна до поверхности.
7.7.4. Инкубируют посевы 14 сут. при температуре (37 +/- 1)
град. С и относительной влажности 80-90%.
7.8. Учет результатов
7.8.1. Учет результатов проводят путем визуального просмотра
засеянных пробирок в проходящем свете на 4, 7, 10, 14 сут.
7.8.2. Сыворотка считается свободной от микоплазм, если через
14 сут. не обнаруживают роста микоплазм ни в одной из засеянных
пробирок.
7.8.3. В случае получения сомнительных результатов проводят
повторный контроль.
7.8.4. При повторном контроле, при наличии роста микоплазм
хотя бы в одной пробирке, сыворотка считается контаминированной
микоплазмами.
8. Контроль сыворотки на присутствие микоплазм методом
индикаторной клеточной культуры (цитохимический метод)
Метод обнаружения микоплазм с использованием индикаторной
клеточной культуры Vero основан на внесении испытуемой сыворотки в
клеточную культуру и обработку препарата специфическим
флюоресцирующим красителем Hoechst-33258, окрашивающим ДНК клеток
и микоплазм. Возможно применение другого флюорохрома,
аттестованного в ГИСК им. . Клеточную культуру Vero
(или другую чувствительную к микоплазмам) получают из банка
клеток, аттестованного в соответствии с требованиями ВОЗ в ГИСК
им. .
8.1. Подготовка к выполнению контроля на присутствие
микоплазм методом индикаторной клеточной культуры
При подготовке к выполнению контроля сыворотки на присутствие
микоплазм методом индикаторной клеточной культуры должны быть
выполнены следующие операции: приготовление основного и рабочего
раствора красителя Hoechst-33258, подготовка люминесцентного
микроскопа, подготовка предметных стекол.
8.1.1. Приготовление основного и рабочего раствора
Hoechst-33258
Соблюдая стерильность, 5 мг концентрата Hoechst-33258
растворяют в 100 мл стерильной дистиллированной воды (основной
раствор).
Для получения рабочего раствора добавляют концентрат красителя
в раствор Хенкса без индикатора в соотношении 1:9 и используют для
окраски препаратов немедленно.
8.1.2. Подготовка люминесцентного микроскопа
Используют для анализа препаратов фильтры: ФС1-4, СС15-2,
х х
БС8-2. Просматривают препараты при увеличении ок. 10 , об. 90
х х
масляная иммерсия, или об. 70 или об. 85 водная иммерсия.
8.1.3. Подготовка предметных стекол
Промывают стекла в проточной водопроводной воде в течение
10-15 мин. Помещают стекла в сосуд с дистиллированной водой и
кипятят 5-7 мин. После охлаждения до температуры 20-22 град. С
извлекают стекла с помощью пинцета и помещают в чашку Петри.
Протирают каждое стекло стерильной салфеткой и помещают на 1 сут.
в смесь Никифорова, состоящую из равных объемов 96 град.
этилового спирта и эфира для наркоза. Извлекают стекла с помощью
пинцета из смеси Никифорова и протирают каждое стекло стерильной
салфеткой. Стерилизуют стекла (30 +/- 2) мин. при температуре (120
+/- 2) град. С.
8.2. Выполнение контроля сыворотки на присутствие
микоплазм методом индикаторной клеточной культуры
При проведении испытания на присутствие микоплазм методом
индикаторной клеточной культуры выполняют следующие операции:
8.2.1. Вносят 1 мл испытуемого материала в чашку Петри
диаметром 90 мм, содержащую стерильное предметное стекло и 20-23
5
мл суспензии клеточной культуры Vero в концентрации 10 кл/мл.
8.2.2. Инкубируют чашку Петри с клеточной культурой Vero в
течение 3-5 сут. при температуре (37 +/- 1) град. С в анаэробных
условиях до формирования 50-70% монослоя. Образование монослоя
х х
наблюдают в световом микроскопе при увеличении ок. 10 , об. 20 .
8.2.3. Сливают культуральную жидкость, промывают препарат
питательной средой или буфером (рН 7,2-7,4).
8.2.4. Помещают предметное стекло на 30-35 мин. в 96 град.
этиловый спирт.
Сливают спирт и высушивают препарат на воздухе.
8.2.5. Добавляют рабочий раствор красителя Hoechst-33258 и
окрашивают в темноте при температуре (37 +/- 1) град. С в течение
30-35 мин.
8.2.6. Сливают краситель, промывают препарат стерильной
дистиллированной водой, подсушивают на воздухе и микроскопируют.
8.3. Учет результатов
Учет результатов испытания на присутствие микоплазм методом
окрашивания ДНК флюорохромом Hoechst-33258 на индикаторной
культуре клеток Vero проводят путем просмотра препаратов в
люминесцентном микроскопе.
Микоплазмы выглядят, как однородно окрашенные тела сферической
формы, имеющие вид отдельных, парных, цепочечных или нитевидных
образований яркого зеленоватого свечения. Диаметр обычно находится
в пределах 0,1-0,3 микрона.
Микоплазмы в виде ярко светящейся зернистости на фоне темной
цитоплазмы выявляют по периферии клеток и в межклеточном
пространстве.
Условно интенсивность контаминации микоплазмами обозначают
знаками креста:
1 крест - единичные микоплазмы в препарате;
2 креста - небольшие скопления микоплазм в поле зрения;
3 креста - отдельные микоплазмы и скопления в 20-50% клеток;
4 креста - максимальное количество микоплазм в виде скоплений
в межклеточном пространстве в каждом поле зрения.
В качестве положительных контрольных образцов используют
заведомо контаминированные микоплазмами клеточные культуры.
Отрицательными контрольными образцами служат клеточные
культуры, в которых описанные выше светящиеся образования не
выявлены.
Обнаружение микоплазм в препаратах на индикаторной клеточной
культуре Vero свидетельствует о контаминации испытуемого материала
микоплазмами.
В случае получения сомнительных результатов следует проводить
повторный контроль.
Окончательный ответ о присутствии микоплазм в сыворотке будет
учитывать результаты двух методов: микробиологического и метода
индикаторной клеточной культуры.
В случае обнаружения микоплазм хотя бы одним методом сыворотка
считается контаминированной и бракуется.
Приложение
Таблица 1
Контроль сыворотки крови крупного рогатого скота
на присутствие посторонних вирусов
--------------------------------T--------------------------------
¦ Клеточные культуры ¦ Результаты контроля ¦
¦ +---------------T----------------+
¦ ¦ ЦПД ¦ Гемадсорбция ¦
+-------------------------------+---------------+----------------+
¦Первично-трипсинизированная ¦ Не обнаружено ¦ Не обнаружено ¦
¦клеточная культура ТБ ¦ ¦ ¦
+-------------------------------+---------------+----------------+
¦Перевиваемая клеточная культура¦ Не обнаружено ¦ Не обнаружено ¦
¦МДВК ¦ ¦ ¦
L-------------------------------+---------------+-----------------
Таблица 2
Контроль сыворотки крови крупного рогатого скота
на присутствие микоплазм
--------------------------T--------------------------------------
¦ Методы ¦ Результаты контроля ¦
+-------------------------+--------------------------------------+
¦Микробиологический (посев¦Отсутствие роста ¦
¦на питательные среды) ¦ ¦
+-------------------------+--------------------------------------+
¦Цитохимический ¦Отсутствие люминесцентного свечения в ¦
¦ ¦индикаторной клеточной культуре Vero ¦
L-------------------------+---------------------------------------
