Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный машиностроительный университет (МАМИ)»
(Университет машиностроения)
УДК
№ госрегистрации
Инв. №
УТВЕРЖДАЮ
и. о. ректора Университета машиностроения
______________________
“____” мая 2016 г.
Курсовая работа
по дисциплине «Основы биохимии и молекулярной биологии»
на тему: «Полифункциональные белки бактерий. Применение в биотехнологии»
Выполнила | Студентка кафедры ЭиПБ, гр. 141-621
| (подпись, дата) |
Руководитель проекта | (подпись, дата) |
Москва, 2016
Реферат
Литературный обзор содержит: 18 страниц отчёта, 3 рисунка, 15 источников литературы
Ключевые слова: полифункциональные белки, бактерии, антимикробные свойства, аминокислоты
Цель работы: изучить явление полифункциональности на примере белков бактерий, а также найти область их применения в биотехнологии
Оглавление
ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………..4
Строение белков. Полифункциональность…………………………..5 Бактерии. Строение бактериальной клетки…………………………6 Полифункциональные белки бактерий……………………………...10 Применение в биотехнологии………………………………………..15ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………...16
Список литературы……………………………………………………….17
ВВЕДЕНИЕ
Белки количественно преобладают над всеми другими макромолекулами, присутствующими в живой клетке, и составляют более половины сухого веса большинства организмов. Белки служат теми инструментами, посредством которых генетическая информация получает свое реальное воплощение. В соответствии с тем, что в клеточном ядре содержатся тысячи генов, каждый из которых определяет какой-то один характерный признак живого организма, в клетке существуют тысячи белков и каждый из них выполняет специфическую функцию. Исследования в области их применения являются важными и имеют большое практическое применение. В России принят ряд важных программных документов, определяющих перспективы и направления развития отечественных биотехнологий, в том числе Комплексная государственная Программа «Развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года» («Био2020», апрель 2012 г.); Дорожная Карта «Развитие биотехнологий и генной инженерии» (июль 2013 г.); подпрограмма «Промышленные биотехнологии» к ГП «Развитие промышленности и повышение ее конкурентоспособности на период до 2020 г.» (апрель 2014 г.). Для координации работ создана межведомственная Рабочая группа по развитию биотехнологий под руководством заместителя Председателя Правительства. Принятые документы предусматривают, в частности, поддержку соответствующих научно-исследовательских работ (НИР) и научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ в этой приоритетной области экономики.
Строение белков. Полифункциональность
Белки являются полимерными молекулами, мономерами которых являются аминокислоты. Общее число встречающихся в природе аминокислот достигает 100, однако некоторые из них обнаружены лишь в определенном сообществе организмов или даже в одном их виде. Вопрос о том, каким образом соединяются между собой многие десятки и сотни аминокислот в белковой молекуле, был предметом пристального внимания многих лабораторий мира, занимавшихся химией белка.
Известно 20 б-аминокислот, постоянно встречающихся во всех белках. Но все они обладают общей структурной особенностью – наличием амино - и карбоксильной групп, соединенных с одним и тем же б-углеродным атомом. R – радикал аминокислот – в простейшем случае представлен атомом водорода (глицин), но может иметь и более сложное строение [1].
Рис.1. Общая структурная формула б-аминокислот
Первой открытой аминокислотой был аспаргин, выделенный из сока спаржи (asparagus).
Полифункциональными называют соединения, в молекулах которых имеется несколько одинаковых функциональных групп.
Среди полифункциональных соединений, участвующих в процессах жизнедеятельности, наиболее широко представлены соединения с гидроксильными и карбоксильными функциональными группами. Специальный интерес представляют в-дикарбонильные соединения. Соединения с несколькими аминогруппами встречаются реже [2].
Бактерии. Строение бактериальной клеткиБактерии представляют собой одноклеточные организмы. Эта группа микроорганизмов наиболее многочисленна, широко распространена в природе и хорошо изучена. Среди бактерий имеется значительное число возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных.
По форме клеток бактерии разделяются на шаровидные — кокки; палочковидные или цилиндрические — собственно бактерии; извитые— вибрионы и спириллы. Между основными формами имеются переходные. Различные формы бактерий показаны на рис. 2.
Рис.2. Многообразие форм бактерий
Структурные компоненты бактериальной клетки делят на основные и временные.
Основными структурами являются:
- клеточная стенка цитоплазматическая мембрана с ее производными цитоплазма с рибосомами и различными включениями нуклеоид
Временные структуры:
- капсула слизистый чехол жгутики ворсинки эндоспоры (образуются лишь на определенных этапах жизненного цикла бактерий, у некоторых видов они отсутствуют полностью).
Клеточная стенка — важный структурный элемент бактериальной клетки, располагающийся между цитоплазматической мембраной и капсулой; у бескапсульных бактерий — это внешняя оболочка клетки. Она обязательна для всех прокариот, за исключением микоплазм и L-форм бактерий. Выполняет ряд функций: защищает бактерии от осмотического шока и других повреждающих факторов, определяет их форму, участвует в метаболизме; у многих видов патогенных бактерий токсична, содержит поверхностные антигены, а также несет на поверхности специфические рецепторы для фагов. В клеточной стенке бактерий имеются поры, которые участвуют в транспорте экзотоксинов и других экзобелков бактерий. Толщина клеточной стенки 10—100 нм, и на ее долю приходится от 5 до 50 % сухих веществ клетки [3].
Основным компонентом клеточной стенки бактерий является пептидогликан, или муреин (лат. murus — стенка), — опорный полимер, имеющий сетчатую структуру и образующий ригидный (жесткий) наружный каркас бактериальной клетки. Пептидогликан имеет основную цепь (остов), состоящую из чередующихся остатков N-ацстил-М-глюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных 1,4-гликозидными связями, идентичные тетрапептидные боковые цепочки, прикрепляющиеся к молекулам N-ацстилмурамовой кислоты, и короткие поперечные пептидные мостики, связывающие полисахаридные цепи. Два типа связей (гликозидные и пептидные), которые соединяют субъединицы пептидогликана, придают этому гетерополимеру структуру молекулярной сети. Остов пептидогликанового слоя у всех видов бактерий одинаков; тетрапептидные белковые цепочки и пептидные (поперечные) у неодинаковых видов различны [2].
Все бактерии подразделяются на две группы: грамположительные и грамотрицательные. В 1884 г. X. Грам предложил метод окраски, который был использован для дифференцирования бактерий. Сущность метода состоит в том, что грамположительные бактерии прочно фиксируют комплекс генцианвиолета и йода, не подвергаются обесцвечиванию этанолом и поэтому не воспринимают дополнительный краситель фуксин, оставаясь окрашенными в фиолетовый цвет. У грамотрицательных бактерий этот комплекс легко вымывается из клетки этанолом, и они при дополнительном нанесении фуксина окрашиваются в красный цвет. У некоторых бактерий положительная окраска по Граму наблюдается только в стадии активного роста. Способность прокариот окрашиваться по методу Грама или обесцвечиваться этанолом определяется спецификой химического состава и ультраструктуры их клеточной стенки. Пептидогликан у грамположительных бактерий — основной компонент клеточной стенки и составляет от 50 до 90 %, у грамотрицательных — 1 —10 %. Структурные микрофибриллы пептидогликана грамотрицательных бактерий сшиты менее компактно, поэтому поры в их пептидогликановом слое значительно шире, чем в молекулярном каркасе грамположитсльных бактерий. При такой структурной организации пептидогликана фиолетовый комплекс генцианвиолета и йода у грамотрицательных бактерий будет вымываться быстрее [4].
Клеточная стенка грамположительных бактерий плотно прилегает к цитоплазматической мембране, массивна, её толщина находится в пределах 20—100 нм.
3. Полифункциональные белки бактерий
В настоящее время трудно оценить общее число белков во всем царстве живой природы, но, учитывая огромное разнообразие организмов, следует признать факт существования по крайней мере многих миллиардов химически индивидуальных белков. Лишь в клетке Escherichia coli содержится более 3000 различных белков. Молекулярная масса белков варьируется от 5 — 10 тыс. до 1 млн. и более. Сравнительно небольшие молекулы белковой природы (молекулярной массой условно до 5000) называются пептидами. К пептидам относятся многие природные вещества с важными биологическими функциями, их синтетические аналоги, а также продукты расщепления белков [5].
Белки, кодируемые единичным геном и обладающие более чем одной функцией, называются полифункциональными.
В природе известно много примеров запасания клетками высокомолекулярных соединений в качестве источников питания и энергии. Эти вещества используются, например, при делении клеток, при наступлении неблагоприятных условий для роста. Клетки запасают в виде включений полисахариды, липиды, полифосфаты, белки, а также (в особых везикулах) газы, железо, и др. Считают, что клеточные включения прежде всего выполняют функцию хранения метаболитов при их избыточном образовании. В то же время включения, не имеющие существенного значения для метаболизма, могут обеспечивать преимущество на отдельных стадиях роста или в особых условиях среды [6].
Образование белковых включений - один из способов экологической стратегии микроорганизмов, часто встречающийся у бактерий. Благодаря ему популяции бактерий накапливают биологически активные белки и сохраняют их в виде включений для помощи дочерним популяциям в конкурентной борьбе за завоевание новых экологических ниш и выживание в них. "Забота" материнских популяций одноклеточных прокариот о дочерних, необходимая для поддержки развития молодых, способных пока только делиться, клеток, в новой экологической нише, рассматривается впервые. Такой способ экологической стратегии, когда белки запасаются бактериями в виде включений для помощи дочерним популяциям в конкурентной борьбе на первых этапах своего развития, характерен именно для прокариот [14].
Однако, в виде включений часто запасаются биологически активные белки. В таком случае эти включения будут обеспечивать преимущество накопившим их организмам, прежде всего, благодаря биологической активности таких белков. Например, морской моллюск Chlamys islandica запасает лизоцимы в виде палочковидных включений в своём кишечнике, используя их для интенсивного расщепления микробной биомассы при питании.
Лизоцимы — полифункциональные белки, которые не только расщепляют ПГ бактериальных клеток благодаря своей ферментативной активности, но и оказывают мембранотропное действие, даже утратив ферментативную активность. Механизм такого действия пока не изучен. Значительно больше примеров образования включений из биологически активных белков известно у бактерий. В ряде случаев установлено, что при растворении таких включений образующие их белки проявляют ферментативную активность или являются токсинами животных, растений [11].
Впервые обнаружена способность белков включений, образуемых бактериями - представителями pp. Bacillus, Xenorhabdus, Photorhabdus, к антимикробному действию. Установлено, что Cry-белки параспоральных кристаллов энтомопатогенных, свободно живущих в почве бактерий Bt, полифункциональны [7]. Они не только с высокой специфичностью убивают, как токсины, чувствительных беспозвоночных (что было известно ранее), но и оказывают бактериоциднодобное и антимикробное действие на ряд микроорганизмов, прежде всего - на прокариот. Показано, что другие белки включений Bt также способны к антимикробной активности. Это Cyt-белки, а также впервые выделенные из кристаллов подвида israelensis уникальные ВШ4-Вй36-белки нового семейства, проявляющие высокую антибактериальную активность, но, в отличие от других белков кристаллов Bt, практически не оказывающие инсектицидного действия [8].
Доказано также, что антимикробный эффект проявляют и некоторые фрагменты Сгу-белков, как сохранившие, так и утратившие способность к инсектицидному действию. Это расширяет возможности борьбы молодых развивающихся из спор популяций Bt с микроорганизмами-конкурентами.
Изучение механизмов антимикробного действия различных белков, образующих включения у бактерий - новое направление исследований. Оно открывает возможности сравнительного изучения неизвестных ранее механизмов антибиотической активности белков.
В последние годы и другие исследователи начали изучать влияние Сгу-белков кристаллов или их фрагментов на микроорганизмы. Способность белков кристаллов убивать не только чувствительных беспозвоночных, но и некоторые микроорганизмы, хотя и менее активно (с эффективностью, свойственной для антибиотиков, а не для токсинов) - важный фактор, который необходимо учитывать при использовании трансгенных растений, в которых экспрессируются cry-гены. Эти исследования необходимы для того, чтобы оценить и научиться предотвращать отрицательные экологические последствия (обусловленные, прежде всего, антимикробной активностью Сгу-белков) расширяющегося внедрения соответствующих трансгенных растений в природные биоценозы.
В последние годы установлено, что бактерии pp. Xenorhabdus и Photorhabdus образуют растворимые инсектицидные токсины. Планируется введение генов, кодирующих такие токсины, в состав комплексных биоинсектицидов. Кроме того, генетики считают возможным вводить гены, кодирующие инсектицидные белки бактерий pp. Xenorhabdus и Photorhabdus в растения, подобно тому, как это осуществлено для Cry-белков. Кроме того, антимикробная активность белков включений этих бактерий также может оказывать ингибирующее влияние на микробоценозы [15].
Белковые включения бактерий родов Xenorhabdus и Photorhabdus:
1.Не способны к инсектицидному действию
2. Проявляют антимикробную активность широкого спектра
3. Проявляют гемолитическую активность
Антибиотическую активность белков параспоральных кристаллов, а также рекомбинантного белка Дестабилазы–Лизоцима и некоторых его мутантов определяли, учитывая размер зоны подавления роста тест-культуры [9].
Исследованные дрожжи Candida guillermondii, Shizosaccharomyces pombe и мицелиальные грибы Botrytis cinerea и Verticillium lateriticum чувствительны к антимикробному действию рД-Л, и в ещё большей степени – к рД-Лt [13].
Жизнеспособность клеток различных исследуемых грибов утрачивалась через 5 – 8 часов после воздействия рД-Л, а после воздействия рД-Лt - через 3 - 5 часов, что также подтверждает более активное антибиотическое действие модифицированной формы белка [10].
Клетки Candida guillermondii разрушались под влиянием рД-Лt.
Рис.3. Микроскопическая картина разрушения клеток Candida guillermondii
1 – контроль
2 –начало лизиса клеток
3 – разрыхление и начало расслоения клеточной стенки, просветление цитоплазмы, начало впячивания мембраны
4 – нарушение наружных слоёв клеточной стенки, их лизис в более молодой почкующейся клетке, потеря значительной части внутренних компонентов клетки
5 –раздувшаяся за счёт осмотического лизиса клетка
6 – расслаивание капсулы, локальное её разрушение, образование кольцевых апоптических структур
Применение в биотехнологии
Поскольку полифункциональные белки – белки, обладающие комплексом свойств, их использование в области биотехнологии отличается широким спектром. Особенно актуально их применение в наиболее важных отраслях, преимущественно, в фармацевтической, так как многие белки обладают антимикробными свойствами [12].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, полифункциональные белки бактерий - белки с уникальной биологической активностью, в том числе, с ранее не изученной антимикробной, которые можно сравнительно легко выделять и исследовать с целью использования в медицине, биотехнологии и других областях. Антимикробная активность белков включений играет важную роль - защищает дочерние популяции на начальных этапах их развития от ряда конкурирующих микроорганизмов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Молекулярная биология. Структура и функция белков, М.: Высшая школа, 1996 – 335 с.
2. Биоорганическая химия: учебник / , , . - 2010. - 416 с.
3. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология, М.: Академия, 2012- 425 с.
4. Прунтова, практикум по общей микробиоло-П85 гии / , ; Владим. гос. ун-т. - Владимир : Изд - во ВлГУ, 2005. - 76 с. Прунтова, практикум по общей микробиоло-П85 гии / , ; Владим. гос. ун-т. - Владимир : Изд - во ВлГУ, 2005. - 76 с.
5. Овчинников, Ю. А. Биоорганическая химия / .-Москва: Просвещение, 1987. - 186 с.
6. Полифункциональные белки бактерий. Учебн. пособие для студ. вузов. — Центр “Академия” Москва, 2005
7. Юдина Т, Г., 1996. Антимикробная активность белковых включений различных бактерий. Доклады РАН. Т.349. №2. С. 283 - 287
8. Юдина ТТ., , 2005. Токсичность Сгу-11А-белка и нового уникального белка из параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis subsp. israelemis для Escherichia coli. Тез докл. П Межд. Конф «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал» ICOMID-2005. 20 - 25 сентября 2005 г. Пермь. С. 110 – 111
9. , Брюханов A. JL, , 2005. Влияние белков параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis и некоторых фрагментов этих белков на анаэробньй бактерий. Тез докл. В Межд. Конф «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал» ICOMID-2005.20 - 25 сентября 2005 г. Пермь. С. 109 - 110
10. Lupetti, A., Paulusma-Annema, A., Welling, M. M., Dogterom-Ballering, H., Brouwer, C. P., Senesi, S., Van Dissel, J. T., Nibbering, P. H. Synergistic activity of the N-terminal peptide of human lactoferrin and fluconazole against Candida species. (2003) Antimicrob. Agents Chemother, 47(1), 262-267
11. Hiroyuki Wakabayashi, Hirotsugu Oda, Koji Yamauchi, Fumiaki Abe. Lactoferrin for prevention of common viral infections. Journal of Infection and Chemotherapy. 30 August 2014
12. Биохимия // М.:ГЭОТАР – МЕД, 2004. – 784 с.
13. Го Даньян. Антибактериальная активность двух форм перспективного лекарственногопрепарата - рекомбинантной дестабилазы-лизоцима из медицинской пиявки // Тезисы докл. Секции «Биология» XIX международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012». Москва, 2012, 168 с.
14. Го Даньян, . Влияние инсектицидных белков Bacillus thuringiensis на бактерий-симбионтов энтомопатогенных нематод // Материалы VII Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, 2011, с.98-100
15. Guo Danyang, Yudina T. G., Netrusov A. I. Morphological changes in the Prokaryotes lysed byprotein in crystal-like inclusions of Bacillus thuringiensis (in chinese). Fourteenth NationalConference on Environmental Microbiology. Xiamen, The proceedings book, 2011.P.308
