Молекулярная биофизика (стр. 22 )

(1) снижение энтропии,

(2) химическая стабилизация переходного состояния (‡),

(3) использование специализированных химических инструментов.

Рассмотрим в качестве примера функционирование фермента триозофосфатизомераза (ЕС 5.3.1.1) (рисунок 132).

Рисунок 132 – Фермент триозофосфатизомераза: 1 – молекула субстрата в ак-

тивном центре фермента

который является ферментом, имеющим некоторые ограничения по скорости протекания реакции, – фермент производит химические трансформации с большей скоростью, чем скорость диффузии субстратов к ферменту. Этот фермент использует все приёмы ферментативного катализа. Он представляет собой димер, состоящий из двух идентичных субъединиц, каждая из которых имеет свой активный центр, в котором связывается молекула субстрата.

Молекула фермента намного больше молекулы субстрата. Практически весь объём молекулы фермента является той необходимой "инфраструктурой", единственное назначение которой – это точно локализовать в пространстве те несколько ключевых аминокислот, которые и

осуществляют химическую трансформацию.

Триозофосфатизомераза катализирует реакцию изомеризации, удаляя два атома водорода от дигидроксиацетон-фосфата, а затем добавляя эти же атомы в другие позиции в молекуле, образуя глицеральдегид-3-фосфат. Реакция осуществляется в два этапа.

На первом этапе, изображенном в верхней части рисунка 133, глутаминовая кислота принимает на себя один из атомов водорода от субстрата, а гистидин добавляет к молекуле субстрата другой атом водорода.

На втором этапе, изображенном в нижней части рисунка 133, глутаминовая кислота присоединяет этот "лишний" атом водорода к субстрату, но уже в другой позиции, а гистидин "отнимает" себе недостающий ему атом водорода от субстрата, но не с позиции, куда он добавлял водород, а а с другой позиции.

Заметим, что фермент в итоге оказался в том же состоянии, что и до

начала реакции – со свободной глутаминовой кислотой и с атомом водорода, связанным с гистидином (хотя атом водорода уже другой). Таким образом, по завершении реакции, молекула фермента готова к следующему преобразованию субстрата в продукт, когда диффузия "доставит" субстрат к ферменту.

Рисунок 133 – Схема реакции изомеризации, катализируемая ферментом

триозофосфатизомераза

В данной ситуации фосфатная группа субстрата окружена целым набором аминокислот фермента, которые расположены в пространстве так, что они образуют "карман" в теле фермента (рисунок 134(а)). Локализация фосфатной группа молекулы субстрата точно позиционируется благодаря системе водородных связей с окружающими аминокислотами (показаны пунктиром на рисунке 134), а область изомеризации  - располагается близко по отношению к глутаминовой кислоте и гистидину активного центра фермента.

Фермент ускоряет химическую реакцию, стабилизируя переходное

состояние в обоих этапах. Переходное состояние первого этапа показано на рисунке 134(б). Глутаминовая кислота уже приняла на себя атом водорода, а гистидин ещё не отдал свой водород субстрату. В результате субстрат оказался

избыточно отрицательно заряженным (энергетически невыгодно), но этот

избыточный отрицательный заряд, сконцентрированный на одном из атомов кислорода, стабилизируется расположенным рядом положительно заряженным лизином.

Рисунок 134 – Схемы: а – ориентации субстрата в ферменте; б – стабилизациипереходного состояния

Далее рассмотрим вопрос о снижении ферментами энтропии химических реакций.

Ферменты ускоряют химические реакции, собирая все необходимые компоненты в нужном месте в нужное время. Энтропия препятствует протеканию химических реакций, снижая вероятность того, что реагирующие молекулы встретят друг друга и провзаимодействуют необходимым образом.

В бимолекулярных реакциях энтропия снижает вероятность встречи обеих реагирующих молекул. В реакциях требующих однозначной ориентации реагентов для преобразования химических связей, энтропия снижает вероятность выбора строгой ориентации из большого числа других взаимных ориентаций реагентов.

Ферменты как раз и являются теми молекулярными приспособлениями, которые минимизируют энтропийный фактор, оптимально позиционируя реагенты в пространстве и стимулируя перенос функциональных групп в нужном направлении. Активные центры топологически и химически соответствуют молекулам субстратов (комплементарны), образуя гидрофобные, электростатические, водородные и (редко) ковалентные связи субстрата с ферментом. Фермент обычно контактирует с большей частью молекулы субстрата, а некоторые ферменты полностью закрывают активный центр со связанным субстратом, используя белковые петли и домены в качестве "ворот" и "крышек".

Обычно активный центр фермента содержит две области.

Первая – это область (карман, складка) специфичности, которая

распознает необходимый субстрат и прочно связывается с ним.

Вторая область является каталитической, в которой собственно и

происходят химические трансформации субстрата в продукт.

Область обеспеивающая специфичность (которой зачастую является практически весь активный центр) в большинстве ферментов является необходимым компонентом, поскольку каталитический центр обычно стимулирует протекание достаточно сложных химических преобразований атомов в молекуле, и при этом сама структура каталитического центра должна соответствовать  субстрату для оптимизации каталитического процесса, а не просто для связывания субстрата.

Характерные размеры при "подгонке" ферментов и их субстратов составляют доли нанометров. Именно такая высокая точность обеспечивает экстраординарную специфичность ферментов. Природные ферменты в

большинстве своем способны отличать молекулы субстратов, различающихся одним единственным атомом. Они также демонстрируют высокую

стереоспецифичность, четко разделяя левые и правые формы молекул

или синтезируя только одну из множества возможных форм продукта.

Стабилизация ферментами переходного состояния химических

реакций.

После присоединения субстрата к ферменту фермент формирует белковое окружение, которое стимулирует необходимые химические преобразования. Ферменты именно потому и способны катализировать химические реакции, что они стабилизируют промежуточное, переходное состояние реакции.

Это достигается различными способами, выбор которых определяется спецификой конкретной реакции.

(1) Иногда химические группы соседних аминокислот или простетических групп воздействуют на субстрат, модифицируя его электронную структуру и делая его (или некоторый его участок) более реакционноспособным (см., например, рисунок 134(б)). Заряженные аминокислоты могут поляризовать близлежащие химические связи субстрата, облегчая преобразование связей определенного атома или, наоборот, активируя определенный атом для его "атаки" на конкретную химическую группу. Водородная связь может стабилизировать ту конформацию субстрата, которая обычно редко встречается в молекуле свободного субстрата, но которая как раз и нужна для осуществления данной реакции.

(2) Во многих случаях формирование переходного состояния может

приводить к образованию нестабильных заряженных форм молекулы с

одним или несколькими атомами, находящимися в неоптимальном

состоянии. Такое состояние может быть стабилизировано посредством

размещения рядом с таким атомом противоположно заряженной амино-

кислоты. В этом случае стабилизировать переходное состояние будет

электростатическое взаимодействие (см., например, рисунки 134(б),

152(4), 154(б)).

(3) Ферменты могут также инициировать напряжения в субстратах за счет жестко фиксированного взаимного расположения аминокислот (геометрия). В случае, когда геометрия субстрата изменяется в ходе реакции, форма активного центра является комплементарной именно переходному состоянию субстрата, а не его исходной форме. В этом случае связывание субстрата с таким активным центром фермента будет вызывать трансформацию субстрата из исходного состояния в переходное состояние (например, тетраэдризация углерода, ).

Первичные механизмы ферментативных реакций.

Большинство ферментов используют специфические реакции для непосредственного химического воздействия на субстрат. Важно, что эти реакции обратимы и возвращаются в исходное состояние после того, как фермент завершит преобразования субстрата.

В этом и заключается фактическое  определение понятия катализатора: фермент может претерпевать некоторые изменения в ходе реакции, чем он собственно и способствует её интенсификации, но он обязательно возвращается в исходное состояние, после чего он снова готов катализировать эту же реакцию.

Перечислим некоторые, наиболее характерные для ферментативного катализа химические инструменты.

(1) Ферменты обычно используют реакционноспособные аминокислоты для направленной химической модификации субстратов. Например, многие ферменты используют специфические аминокислоты для переноса атома водорода в пределах молекулы. В частности, для этого часто используется гистидин. При нормальных физиологических условиях достаточно легко удалить один из водородных атомов гистидина, а затем вернуть его на место. Гистидин используется во многих реакциях, в которых перестраивается структура молекулы. На гистидин переносится атом водорода, а затем этот атом возвращается на молекулу субстрата, но уже в другую позицию. В результате либо изменяется геометрия молекулы, либо смещается местоположение двойной связи в молекуле субстрата (см. рис. 133).

(2) В других реакциях требуется более "мощное" воздействие. В таких случаях аминокислоты ферментов, атакуя субстрат, формируют ковалентную связь с субстратом. В данном случае, получившееся переходное состояние является нестабильным, и на следующем этапе реакции либо эта вновь сформированная связь, либо одна из других нестабильных связей разрушается и образуется необходимый продукт реакции.

Так, например в сериновой протеазе серин атакует пептидную связь

в субстрате, разрывает ее и образует нестабильную связь с одним из фрагментов. После чего в активный центр дифундирует молекула воды, диссоциирует там на ОН– и Н+, затем ОН– взаимодействует с субстратом,

нестабильная связь рвется, и фермент возвращается в исходное состояние.

(3) В некоторых реакциях ферменты вводят новые атомы и функциональные группы к растущей молекуле. Многие молекулы являются носителями таких специфических атомов и групп. На рисунке 135 приведены примеры таких молекул.