Оценка мышечного фиброза после лечения сурамином.

24  мыши  использовали для этого эксперимента. Обе  икроножные мышцы мышей повреждены. Мыши были разделены на 12 групп по 2 мыши  / группа (4 мышцы / группы). Различные концентрации сурамина (0, 0,25, 1 и 2,5 мг в 20 мкл PBS) вводили в каждый момент времени (0, 7 и 14 дней). Через две недели после инъекции все животные были убиты для оценки заживления и регенерации мышц. Шестнадцать мышц в момент времени (4 мышцы / концентрация) были использованы для регулярного гистологического и иммуногистохимического окрашивания. Окрашивание коллагена и виментина  проводили для выявления фиброза в поврежденной мышце, как описано ранее. Промежуточные филаменты  виментина были  использованы  в качестве маркера рубцовой ткани в данном исследовании, поскольку он экспрессируется в  соединительной ткани. Виментин экспрессируется в  мышечных волокнах на ранних стадиях развития, и вскоре после травмы (<2 недели), однако, зрелые мышечные волокна не выражают этого белка. Короче говоря, для окрашивания коллагена срезы фиксировали в 10% формалине в течение 10 мин. После чего  срезы промывали в деионизированной воде,  трехцветная  изменение окраски было выполнено в соответствии с протоколом производителя (IMEB, Сан-Маркос, Калифорния).

Иммуногистохимия виментина  была выполнена  с фиксацией секций, как описано выше. После 45 минут блокировки в 5% лошадиной сыворотке (Vector, Burlingame, CA), эти слайды инкубировали с анти-виментин сопряженными Cy3 (1:500, Sigma Chemical). Площадь поверхности фиброза в различных группах была измерена с помощью ранее описанной методике. Эти измерения были получены  независимым исследователем, который не знал, какие группы лечили или использовались как элементы контроля, обеспечивая тем самым объективность результатов. Для измерения общего виментина или коллагена использовали  флуоресцентный микроскоп, 10 случайных полей были выбраны для каждого образца. Изображения были собраны с помощью Olympus  эпифлуоресцентного микроскопа (Olympus Optical, Токио, Япония) и Sony 970 3  (Sony, Токио, Япония). После того как они были оцифрованы с помощью  Coreco Imaging (Coreco, Сен-Лоран, Квебек, Канада) и доводится до монохромного цвета, характеристики были извлечены, и абсолютные области с виментина-положительным окрашиванием измерялась в каждом поле изображения.

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

Оценка восстановления мышц после терапии сурамином.

Гематоксилин и эозин были  использованы для мониторинга числа регенерирующих мышечных волокон в поврежденных областях, обработанных сурамином (0, 0,25, 1 или 2,5 мг в 20 мкл PBS), и результаты были сопоставлены между различными группами.  Клетки  с центрально расположенными ядрами считаются регенерирующими  мышечными волокнами. Ядра без какой-либо заметной окружающей цитоплазмы были отброшены. Независимый  наблюдатель осуществлял подсчет. Общее количество регенерирующих мышечных волокон в месте повреждения оценено количественно, используя пять случайных полей, выбранных из каждого образца в соответствии с ранее описанным протоколом.

Физиологическая оценка сократительных свойств мышц после терапии сурамином.

Двадцать четыре мыши были использованы для физиологических испытаний, которые были основаны на ранее описанных протоколах. Икроножные мышцы левой ноги у каждой мыши повреждены, как описано выше, и в них вводят  сурамин через  14 дней после травмы. Икроножная мышца  правой ноги у каждой мыши была извлечена  и сохранены. Шесть мышей в каждой группе [вводили 0 (контроль), 0,25, 1 или 2,5 мг сурамина в 20 мкл PBS] были подвергнуты  физиологическому тестированию для  определения восстановления функций через 14 дней после инъекции. Мыши были под наркозом, используя низкие дозы (80 мг / кг массы тела животного) пентобарбитала натрия при  внутрибрюшинном введении. Обе икроножные мышцы были извлечены  и смонтированы в двойной оболочке  в ванночку из 5 мл при 36 ° C в раствор Кребса (в мм: 113 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 CaCl2, 1,2 MgSO4, 25 NaHCO3, 1,2 KH2PO4, 11,5 глюкоза) и постоянно перемешивают с смесью из 95% кислорода и 5% углекислого газа. Время между извлечением  мышцы и началом  измерения силы была <1 мин для всех  мышц. Начальная напряженность была установлена ​​на уровне 20 мН; изометрические сокращения измеряли с помощью  тензометрических преобразователей в сочетании с TBM4 тензометрическим усилителем (инструменты Всемирного Precision, Сарасота, Флорида) и записан на компьютере с помощью программы сбора данных (Windaq, DATAQ инструменты, Акрон, Огайо). Частота дискретизации на канал была установлена на уровне 500 Гц. Амплитуда стимуляции сокращений  была вычислена по расчету программы (WindaqEx, DATAQ). Через 20 мин  мышцы выведены из равновесия  электрическим стимулом  через два платиновых  электрода, расположенных на верхнем и нижнем концах  ванны (разделенных на 4 см). Мышцы были стимулированы  импульсом длительностью по 0,25 мс с максимальным напряжением (50 В). Во-первых, стимуляция в  1-Гц была  использована, и сокращения мышц  записаны. Тетаническое раздражение затем было применено с 0,5-с  продолжительностью в 100 Гц каждые 10 с. Наконец, каждая мышца была взвешена с помощью микровесов (Mettler Toledo, Greifensee, Швейцария). Измерения напряженности были записаны и выражается в мг-ньютонов на грамм.

Статистический анализ.

Различия в пролиферации клеток  между контрольной группой и экспериментальными группами, обработанными сурамином (50 мкг / мл) были проанализированы с помощью Стьюдент-теста. Статистическое сравнение фиброзных площадей, количества регенерирующих мышечных волокон, и  силы в различных группах проводились при помощи анализа  ANOVA. Различия между группами были проанализированы с помощью Bonferroni  (должность специального теста). Статистическая значимость определяется как P <0,05.

Результаты

Влияние Сурамина на фибробластах In Vitro

Антипролиферативное влияние сурамина на пролиферацию фибробластов NIH ​​3T3 описано на  рис. 1. После инкубации в диапазоне от 72 ч до 144 ч, в экспериментальной группе получавших сурамин (50 мкг / мл) наблюдалось  значительное снижение числа фибробластов по сравнению с контрольной группой (без сыворотки среде без сурамина).

Влияние сурамина на внутриклеточные б-SMA и виментин, Вестерн-блот анализ.

Чтобы оценить насколько сурамин влияет на  б-SMA и виментин, мы исследовали влияние сурамина на содержание белка в клетках. Чтобы убедиться в том, что клетки реагируют на сурамин, темп роста был определен. После 72 ч инкубации с сурамином (50 мкг / мл), один набор клеток подсчитывали, чтобы подтвердить, что рост NIH 3T3 фибробластов подавляется значительно. Вестерн-блот анализ показал снижение экспрессии внутриклеточных б-SMA и виментина  при концентрации сурамина 50 мкг / мл. Денситометрическая оценка показала 100% снижение б-SMA и виментина  в клетках, которые  инкубировали с 50 мкг / мл сурамина, 73 и 81% снижение  соответствующих белков при  концентрации 10 мкг / мл сурамина,  и снижение 53 и 45%  соответствующих белков при  1 мкг / мл сурамина по сравнению с контролем (0 мкг / мл сурамина) (таблицы 1 и 2).

Определение биологического и физиологические эффекты Сурамина  на  регенерацию мыш после  повреждения.

Оценка мышечного фиброза после инъекции сурамина.

Гистологическая оценка в сочетании с количественным анализом  коллагена и виментина  на поврежденном  участке  дает предположение, что введение высоких концентраций сурамина (2,5 мг в 20 мкл PBS)  более эффективно предотвращает  фиброз, чем введение более низких концентрациях сурамина (1, 0,25 и 0 мг; рис. 2, 3, 4, 5).. Значительно меньше рубцовой ткани  образуется в экспериментальной группе, получавшей 2,5 мг сурамина, чем в контрольной группе (P <0,05).Тормозящее действие сурамина на развитие фиброза мышц, казалось, зависит от дозы, однако,  значительное снижение фиброза наблюдается при дозах от 1,0  и 2,5 мг сурамина (указано  содержание виментина и коллагена), никаких существенных различий в результатах  не было обнаружено между 0,25-и 1-мг и 1 - и 2,5-мг. Процент  рубцовой ткани через  4 недели после травмы  колебался  от ~ 12,8% от общей площади в контрольной (0 мг сурамина) до 7,9% в 0,25-мг группе, 4,7% в 1-мг и 2,6% в 2,5-мг.

Оценка восстановления мышц после инъекции сурамина.

После инъекции сурамина в мышцы отображаются многочисленные мышечные волокна регенерирующие на  месте разрыва. Эти регенерирующие мышечные волокна были расположены равномерно по всему региону в поверхностных, так и в глубоких частях мышцы (рис. 2).Контроль мышц содержащих  регенирирующие мышечные волокона установил, что  они были в основном расположены в более глубоких районах  области повреждения. В поверхностной области наблюдалась инфильтрация мононуклеарных клеток  и  всего несколько регенерирующих мышечных волокон, большинство в этой области  составляла фиброзная ткань (рис. 2). На

рисунке 6 показано среднее количество регененрирующих мышечных волокон. Все  мышечные волокна  с центрально расположенными ядрами присутствуют  были подсчитаны и сравнены между группами. Мы наблюдали увеличение количества регенирирующих мышечных волокон во всех  группах, получавших лечение  по сравнению с контрольной группой. Однако, только высокие дозы сурамина (2,5 мг) привели к значительно большому количеству регенерирующих  мышечных волокон  по сравнению с контрольной (P <0,01;. Рис. 6).

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4