Антифибротическое действие сурамина в поврежденных скелетных мышцах после повреждения (стр. 1 )

Антифибротическое действие сурамина в поврежденных скелетных мышцах  после повреждения.

Мышечные травмы,  наиболее часто встречающиеся  в спортивной медицине, создают сложные проблемы в травматологии. Мышечное повреждение может происходить через различные механизмы, начиная от прямой механической деформации (например, разрыв мышц, деформация или ушиб) или  косвенного  повреждения, связанного  с ишемией и неврологической дисфункцией. Пострадавшие мышцы обычно проходят процесс  дегенерации и регенерации состоящий из трех фаз. Фаза разрушения  характеризуется формированием гематомы, некрозом мышечной ткани, дегенерацией, и воспалительно-клеточным  ответом. Восстановительный  этап включает в себя фагоцитоз поврежденных тканей, регенерацию поперечно-полосатых мышц, производство соединительнотканного  рубца, и ростом  капилляров. На заключительном этапе реконструкции регенерирующие мышцы созревает  вместе с  реорганизацией рубцовой ткани. Хотя мышечная ткань сохраняет свою способность к регенерации после травмы, процесс заживления, как правило, происходит медленно и часто не полностью. Полное восстановление  скелетных мышц  препятствует развитию фиброза, который обычно появляется в течение второй недели после повреждения мышц и увеличивается с течением времени. Мы создали различные животные модели  мышечной травмы и наблюдали  процесс регенерации в поврежденных мышцах. Долгосрочная цель нашего исследования -  разработка биологических мероприятий по улучшению заживления  мышц после травм. Для достижения этой цели, наша исследовательская группа исследует две основные процедуры: повышение регенерации мышц и предотвращение мышечного фиброза. Мы охарактеризовали влияния нескольких факторов роста на повышение пролиферации миобластов и синтеза в лабораторных условиях. Это привело к идентификации трех перспективных факторов роста [фактор роста нервов, основного  фактора  роста фибробластов, и, в частности, инсулиноподобного фактора роста (IGF) -1], которые улучшают регенерацию мышц. Тем не менее, полное восстановление пострадавших мышц продолжает быть ограничено  развитием  фиброза. Таким образом, мы сосредоточили наши недавние усилия на развитии биологических подходов для предотвращения фиброза мышц после  травм. Перепроизводство трансформирующего  фактора  роста (TGF)-в в ответ на повреждение и заболевание является основной причиной фиброза тканей в организме человека и других животных. В скелетных мышцах, TGF-в1 экспрессируется на высоком уровне и связан с  процессом  фиброзирования  в скелетных мышцах у пациентов с миодистрофией  Дюшенна. Кроме того, во время мышечной травмы, воспалительные реакции, которые  происходят в месте повреждения, приводят к координационному  производству  TGF-в1, который вызывает фиброз через активацию внеклеточного матрикса и разрастание соединительной ткани. Мы также сообщали, что TGF-в является основным фактором в запуске каскада фиброза  в скелетных мышцах. Блокируя фиброзный эффект TGF-в1 с помощью инъекции биологически активных молекул-  декорина, прямого антагониста  TGF-в1 (51), мы обнаружили, что  структура и функция  мышц достигли почти полного  выздоровления. Тем не менее,  очень большое количество декорина  эффективно улучшало  заживление очень маленьких мышц  мышей. Таким образом, мы сосредоточили наши усилия на выявление биологических агентов, которые могут быть использованы клинически и имеют  антифиброзные  эффекты, сопоставимые с декорином. Сурамин (Sigma Chemical, Сент-Луис, Миссури) был первоначально разработан в качестве противопаразитарного  препарата и  подавлял TGF-в  путем конкурентного связывания с рецептором фактора роста. Имея это в виду, мы предположили, что сурамин также может связываться с TGF-в рецептором обычно встречающимся  в клетках  в месте мышечных травм и тем самым предотвращает  активацию  TGF-в1 и его влияние на миофибробласты. Чтобы проверить эту гипотезу, мы провели серию тестов в пробирке, чтобы определить влияние сурамина на фибробласты. В естественных условиях, мы выбрали  модель рваной  раны, чтобы подтвердить антифиброзных эффект сурамина и оценить ее влияние на мышцы.

Материалы и методы

Влияние Сурамина на фибробласты  In Vitro.

Клеточные культуры  NIH 3T3 клеток, известной линии  фибробластов, культивировали в  среде  Дульбекко  в модификации  Игла (Invitrogen, Carlsbad, CA), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10% лошадиной сыворотки, 0,5% экстракта куриного эмбриона, и 1% пенициллина / стрептомицина. Все клетки были выращены при 37 ° С в 5% СО2 в течение 3 дней с периодическим изменениям среды.  NIH 3T3 клетки (2.000 клеток / лунку) высевали в 12-луночные планшеты. После 12-часового инкубационного периода, среда была полностью удалена, а свежую среду роста (без сыворотки) добавляют сурамин (50 мкг / мл). Свежая среда (с  той  же концентрацией сурамина) добавляют каждые 2 дня. Для измерения пролиферации клеток, клетки обрабатывали трипсином и подсчитывали в  гемоцитометре. Пять отдельных пластин в группе на момент времени были оценены и по сравнению с контролем (без сыворотки в  среде, без сурамина) через  24, 48, 72, 96, 120 и 144 ч инкубации.

Вестерн-блоттинг.

Для анализа влияния TGF-в1 в мышцах, липофектин (Invitrogen) использовали для трансфекции в C2C12 клетки  плазмидой, кодирующей TGF-в1 и неомицин, как описано ранее. После выбора  G418 (500 мкг / мл, Invitrogen), C2C12 клетки, экспрессирующие TGF-в1, были названы "CT клетки". Такое же количество (105) СТ клеток клона  помещали в различные Т-25 колбы и обрабатывали  сурамином в концентрации 0, 1, 10 и 50 мкг / мл. Параллельно с ростом проведены  три  независимые испытания. Экспрессия  б-актина гладких мышц (б-SMA) и виментина, оба из которых являются маркерами миофибробластов, была оценена в этих клетках. После 72-часового периода инкубации клетки дважды промывают фосфатным буферным раствором (PBS; Roche, Indianapolis, IN) и лизировали лизат буфера [отношение в-меркаптоэтанола в буфере для образцов (62,5 мМ Tris · HCl, рН 6,8, 2% SDS, 25% глицерина) = 1:20]. После этого весь лизат клеток центрифугировали при 3000 г в течение 5 мин и супернатант собирали и хранили при 4 ° C. Образцы были проанализированы с помощью 12% SDS-полиакриламидного геля. Концентрации белка определяли с помощью методологии Брэдфорд. Четыре мкг белка из каждого образца были загружены, и  разделены при  55 В в течение 1 ч и 75 В в течение 3 часов. Затем мы передали общий белок на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad, Hercules, CA) с использованием 60 V. Мембраны промывали в PBS в течение 5 мин и блокировали 1% обезжиренного сухого молока и 2% лошадиной сыворотки в Triton-PBS (T-PBS, 0,01%) в течение 1 ч при комнатной температуре ( 60 циклов / мин). Первичные  антитела  против б-SMA (1: 1000, Sigma Chemical) были  применены  при комнатной температуре в течение 1 ч, во время которого блоты промывают четыре раза в T-PBS. Вторичные антитела анти-IgG мыши конъюгированные  с пероксидазой хрена (1:8,000, Pierce, Rockford, IL) были  применены в течение 1 ч, после чего пятна снова промывают 4 раза в T-PBS (15 мин / цикл). После чего  блоты промывают, они были оценены  с помощью усиленной хемилюминесценции, а положительные группы были определены с помощью рентгеновской пленки. Для оценки экспрессии виментина, тот же протокол был выполнен с помощью различных антител. Первичные  антитела против виментина (1:1000, Sigma Chemical) и вторичные антитела анти-IgG козы конъюгированные  с пероксидазой хрена (1:8,000, Pierce) были использованы. Рентгеновские пленки  из трех независимых  блотов для каждого антитела были отсканированы и оценены (версии 6.0, Empix Imaging, North Tonawanda, Нью-Йорк) путем расчета оптической плотности каждой полосы белка. Анализ изображений  был выполнен в черно-белом, а сигналы изображения на линейной части были выражены в сером значении в диапазоне от 0 до 256 пикселов.

Определение биологического и физиологического  эффекта  Сурамина  на регенерацию мышц  после  повреждения.

Животные модели.

Модель  рваной раны была разработана на  мышах (C57BL10J + / +; Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) на основе ранее описанных исследованиях. Сорок четыре мыши, в среднем возрасте 8 недель и примерным весом 18-22 г, были использованы в эксперименте. Животных содержали в клетках и кормили коммерческим кормом  и не  ограничены в  воде. Комитет по исследованию на животных  утвердил протоколы исследований, используемые для этих экспериментов (протокол №. 5/01). Мыши были под наркозом, используя низкие дозы (80 мг / кг массы тела животного) пентобарбитала натрия (Anpro Pharmaceuticals, Arcadia, CA). Мышцы поврежденные  хирургическим лезвием (№ 11) на  50% от их ширины и 100% от их толщины. Полидиоксанон шовный материал (PDSII 5-0, Ethicon, Somerville, NJ), 4 мм в длину, был помещен в медиальные  края  на каждой  стороне каждой ноги. После того, как рваная рана была сделана, кожа была закрыта  4-0 черным шелком. Сурамин вводили по  шовному  материалу  микрошприцом. Мыши были разделены на три группы на основании различных моментов времени после  рваной  раны (0, 7 и 14 дней). В каждый момент времени, четыре различные концентрации сурамина (0, 0,25, 1 и 2,5 мг в 20 мкл PBS) были использованы. В группе (отрицательный контроль), мышцы были повреждены, как в экспериментальных группах, но вводили только  PBS. Два животных в группе были оценены гистологически. Все животные были убиты для оценки заживления и регенерации через  2 постинъекционных недели. Икроножные мышцы были изолированы и замораживали в 2-метилбутан предварительно охлаждается в жидком азоте. Регулярные гистологические и иммуногистохимические методы  для оценки экспрессии виментина были использованы для оценки развития рубцовой ткани после травмы.