Обзоры (стр. 2 )

Благодаря особенностям жизненного цикла вирусов, первые векторы (носители трансгенов) для генотерапии стали изобретать именно на их основе. Вирусы переносят чужеродные гены, которые затем способны экспрессироваться в клетках-мишенях. Упрощенно вирус можно представить как нуклеиновую кислоту, упакованную в оболочку; вирус проникает в клетку-мишень, где происходит экспрессия его генома. Для создания хорошего вектора необходимо изменить некоторые его свойства. В большинстве случаев вирус должен быть лишен способности к репродукции, чтобы предотвратить неконтролируемое распространение трансгена. Вирусные векторы широко используют в доклинических исследованиях и в настоящее время именно с ними проводят большинство клинических испытаний. А. Al-Hendy и соавт. [26] осуществили сайленсинг («выключение» подавление генов при помощи эпигенетических механизмов, не затрагивающих последовательности ДНК) гена MED12 в клетках лейомиомы матки человека in vitro с помощью специфической лентивирусной РНК-интерференции (процесс «разрезания» молекулы РНК при помощи особого фермента, который тормозит экспрессию соответствующего гена). Авторы отметили, что в клетках, нокаутных по гену MED12 (т. е. данный ген в этих клетках был подвержен инактивации), наблюдался пониженный уровень экспрессии Wnt4 и в-катенина (см. ниже), что сопровождалось уменьшением клеточной пролиферации. В дополнение к этому в измененных клетках был зафиксирован пониженный уровень регуляторных белков клеточного цикла (циклин D1, Cdk1, Cdk2) и сигнального пути трансформирующего ростового фактора-в (TGF-в). Авторы сделали вывод, что сайленсинг гена MED12 позволяет в значительной степени подавить опухолевый рост в клетках миомы матки. В серии других лабораторных работ были продемонстрированы антипролиферативные и проапоптотические эффекты аденовирусной трансдукции клеток миомы различными векторами, содержащими вирусную тимидинкиназу, c последующим воздействием ганцикловира (препарат, обладающий противовирусной активностью) in vitro и in vivo [27—29]. S. Shalaby и соавт. [30] показали, что эффективность этого процесса можно дополнительно повысить, используя магнитные наночастицы в ходе магнетофекции (метод образования в плазматической мембране отверстий, через которые внутрь клетки может проникать внеклеточный материал, например, наночастицы, содержащие нуклеиновую кислоту). Эксперты подчеркивают, что, несмотря на продемонстрированную высокую противоопухолевую эффективность генно-инженерных методик в ходе лабораторных работ, оценить реальные перспективы этого направления для клинической медицины невозможно до проведения экспериментов на более сложных гуманоидных моделях, а также в рамках доклинических испытаний на человеке.

Другой потенциальный подход к разработке новых лекарственных препаратов для лечения больных с миомой матки заключается в углубленном изучении молекулярной биологии миомы матки, а именно — каскадов внутриклеточных реакций, которые лежат в основе туморогенеза [31]. К настоящему моменту накоплен значительный объем экспериментальных данных, посвященных данному вопросу. Так, была установлена патофизиологическая роль таких сигнальных каскадов, как Smad 2/3, PI3K, ERK Ѕ и в-катениновый путь. Эти каскады регулируют воспалительный ответ, фиброз, пролиферативные процессы и ангиогенез в миоматозных узлах, а потому являются перспективными фармакодинамическими мишенями [32]. Smad — это группа внутриклеточных белков, которые осуществляют трансдукцию внеклеточных сигналов, индуцируемых цитокинами семейства трансформирующего ростового фактора-в. Эти белки подразделяются на три категории: рецептор-регулируемые (R-Smad), ко-медиаторные (Co-Smad) и ингибиторные (I-Smad) [33]. Каскад запускается после связывания лиганда (например, активин-А или TGF-в1) с рецептором II типа (ActRIIA или TFG-вRII, соответственно), что влечет за собой укомплектовку (рекрутинг) и активирующее фосфорилирование соответствующих рецепторов I типа. Последние, в свою очередь, фосфорилируют белки Smad2 и Smad3 (относящиеся к R-Smad), которые далее взаимодействуют с Co-Smad в цитоплазме. Образовавшийся белковый комплекс транспортируется в ядро, где происходят взаимодействие с другими транскрипционными факторами и регуляция экспрессии таргетных генов [34]. В клетках миомы было отмечено повышенное содержание Smad3, Co-Smad, а также рецепторов TGF-вRI и TGF-вRII, что отчасти обусловливает тенденцию к опухолевому росту [35].

Другим молекулярным каскадом, играющим важную роль в патогенезе миомы матки, является PI3K-путь. PI3K — это крупное семейство внутриклеточных вторичных мессенджеров. Активация данного пути может происходить с помощью рецепторов, связанных с G-белками, и тирозинкиназных рецепторов [36]. В ходе экспериментальных исследований была продемонстрирована индукция PI3K-каскада в клетках лейомиомы матки под действием пролактин-высвобождающего пептида (англ. — prolactin-releasing peptide, PrRP) и эпидермального ростового фактора (EGF) in vitro [37]. Связывание с лигандом влечет за собой активацию рецепторного комплекса, что приводит к фосфорилированию мембранного белка PI3K. Последний осуществляет конверсию PIP2 (фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата) в PIP3 (фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат), который опосредует фосфорилирование протеинкиназы B (PKB/AKT). Данный фермент впоследствии активирует или дезактивирует ряд других белков каскада, что способствует дальнейшей передаче сигнала. Наиболее изученным субстратом PKB/AKT является белок mTOR (англ. — mammalian target of rapamycin). Активация комплекса mTORC1 — Raptor приводит к фосфорилированию дальнейших субстратов, к числу которых относятся фактор трансляции 4E-BP1 и p70S6-киназа, что способствует интенсификации синтеза таргетных генов. Накопленные данные позволяют с уверенностью утверждать, что каскад PI3K/AKT/mTOR занимает одну из центральных позиций в патогенезе миомы матки. J. Crabtree и соавт. [38] продемонстрировали апрегуляцию этого пути в клетках лейомиомы человека и крысы in vitro и in vivo. Среди прочего, ученые обнаружили, что воздействие аналога рапамицина — WAY-129327 — приводило к уменьшению размеров и количества миоматозных узлов у крыс линии Eker В другой экспериментальной работе было установлено, что воздействие MK-2206 — ингибитора AKT — позволяет уменьшить фосфорилирование mTOR и p70S6K, что ассоциируется с апоптозом клеток миомы in vitro [39]. Исследовательская группа B. Varghese [40] провела серию экспериментов, которые подтвердили, что PrRP стимулирует пролиферацию клеток лейомиомы в культуре за счет активации PI3K/AKT/mTOR-пути. И напротив, экзогенное ингибирование AKT c помощью специфического антагониста данного фермента (API-59) приводило к гипопролиферации, снижению жизнеспособности и усилению апоптоза миоматозных клеток in vitro [41]. N. Friedman и соавт. [42] инкубировали клетки миомы и неизмененного миометрия, взятые в ходе гистерэктомии, в среде, содержащей трансретиноевую кислоту (ATRA от англ. — «all trans-retinoid acid») в сочетании со специфическим супрессором PI3K-пути (LY294002) или без него. АТRА — производное витамина A — с огромным успехом используется в онкологии для лечения больных с промиелоцитарным лейкозом. Авторы применяли вестерн-блоттинг (аналитический метод, используемый для определения в образце специфических белков) для оценки различий в экспрессии различных целевых генов и колориметрический метод для идентификации пролиферативого потенциала; основным статистическим методом стал дисперсионный анализ (метод математической статистики). Было обнаружено, что ATRA подавляет пролиферацию миометриальных (в большей степени) и миоматозных клеток (в меньшей) за счет супрессии PI3K-каскада. Авторы сделали вывод о значимости сигнальных каскадов вторичных мессенджеров в патогенезе миомы матки и необходимости дальнейшего изучения потенциального противоопухолевого действия ATRA в отношении этих новообразований.

Другим важным сигнальным каскадом является путь ERK Ѕ. Последний является цитопоплазматическим белком, который опосредует передачу сигнала от EGF, тромбоцитарного ростового фактора (PDGF), инсулиноподобного ростового фактора-I и TGF-в в клетках миомы и здорового миометрия [43, 44]. Каскад инициируется после связывания лиганда с соответствующим рецептором, после чего происходит активирующее аутофосфорилирование рецепторного комплекса. Последний ассоциирован со вспомогательными белками Grb2 (англ. — growth factor receptor-bound protein 2) и Shc, которые обеспечивают рекрутинг гуанин-нуклеотидного обменного фактора под названием SOS (англ. — son of sevenless). Данный фактор способствует активации мессенджера Ras путем переноса фосфатной группы между ГДФ и ГТФ. Ras — это небольшой ГТФ-связывающий белок, который рекрутирует и активирует другой вторичный мессенджер — Raf. Описанный каскад внутриклеточных молекулярных реакций приводит к активации комплекса ERK Ѕ, который транспортируется в ядро и влияет на транскрипцию таргетных генов [45, 46]. Значительная роль этого каскада в патофизиологии миомы матки была продемонстрирована в серии экспериментальных исследований. Так, L. Yu и соавт. [44] зафиксировали повышенную экспрессию Shc, Grb2 и ERK в клетках миомы матки по сравнению с клетками здорового миометрия. В другой работе была отмечена активация каскада ERK Ѕ в результате воздействия эстрогенов на миоматозные клетки, но не на интактный миометрий. E. Nierth-Simpson и соавт. [47] в ходе экспериментов in vitro обнаружили, что стимуляция клеток лейомиомы матки с помощью EGF приводит к значительному повышению продукции реактивных окислительных радикалов внутри клеток, что влечет за собой активацию ERK Ѕ и усиление клеточной пролиферации. При этом применение AG1478 и TKS050 — селективных блокаторов рецепторов EGF — может останавливать пролиферацию миоматозных клеток, а также индуцировать апоптоз [48, 49]. в-Катенин является центральным компонентом сигнального WNT-каскада (англ. — wingless type). В отсутствие специфических лигандов этот белок быстро деградирует в цитоплазме под действием «деструктивного комплекса». Упомянутый комплекс содержит белки APC и AXIN, которые опосредуют фосфорилирование в-катенина ферментами CK1 (казеинкиназа 1) и GSK3 (киназа 3 гликогенсинтазы). В присутствии лигандов WNT связывается с особыми frizzled-рецепторами и с некоторыми ко-рецепторами (такими как LRP-5/6, RYL, ROR2), что приводит к ингибированию «деструктивного комплекса» и стабилизации в-катенина в цитоплазме. Последний транспортируется в ядро и взаимодействует с транскрипционными факторами LEF/TCF (англ. — lymphoid enhancer factor/T-cell factor), что приводит к изменению экспрессии таргетных генов [50]. К настоящему времени накоплен значительный массив экспериментальных данных, указывающих на большую роль WNT/в-катенинового каскада в патогенезе миомы матки. P. Tanwar и соавт. [51] использовали в качестве экспериментальной модели мышей с конститутивной экспрессией в-катенина и зафиксировали значительное повышение частоты развития мезенхимальных опухолей в матке. Экспериментальная работа на лабораторных мышах, проведенная М. Ono и соавт. [52], продемонстрировала центральную роль WNT/в-катенинового пути в туморогенезе миомы матки: ученые обнаружили, что эктопическая экспрессия ингибитора в-катенина и TCF4 приводила к остановке гормонзависимого опухолевого роста в клетках — предшественниках лейомиомы матки in vivo. Кроме того, в этих клетках была зафиксирована повышенная экспрессия frizzled-рецепторов (FZD1 и FZD7) и ряда других ко-рецепторов WNT.