Рисунок 9. Карнозин индуцирует G2 блок в клетках U-118-MG. Клетки инкубировали с карнозином (20 – 100 мМ) в течение 24 ч, метили 5-бромдезоксиуридином (БДУ) и считали количество БДУ-положительных (S фаза) и БДУ-отрицательных (G1 и G2 фазы) клеток на проточном цитометре. (А) Пример распределения клеток U-118-MG по фазам клеточного цикла. (Б) Процентное распределение клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после инкубации с карнозином. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества клеток в контроле; n=3, p<0.05.
Прохождение клетки через фазы клеточного цикла регулируется последовательной экспрессией циклинов. Циклин В1 специфически экспрессируется во время G2 фазы (Grana and Reddy 1995). Было показано, что индукция G2 блока в присутствии некоторых антиоксидантов, например, витамина С, сопровождается усилением экспрессии циклина В1 (Thomas et al 2005). Для того чтобы определить, связано ли индуцированное карнозином накопление клеток в G2-фазе с изменениями экспрессии циклина В1, клетки U-118-MG обрабатывали 50 и 100 мМ карнозина в течение 24 ч и измеряли уровень белка и мРНК циклина В1. С помощью метода иммуноблоттинга было выявлено, что обработка клеток глиобластомы карнозином (50 – 100 мМ) индуцирует увеличение количества белка циклина В1 в 2,5 – 4 раза (Рис. 10.А). Повышение уровня белка циклина В1 было сопряжено с увеличением уровня мРНК (Рис. 10.В).
Рисунок 10. Карнозин усиливает экспрессию циклина B1 в клетках U-118-MG. Клетки инкубировали с карнозином (50 - 100 мМ) в течение 2 - 24 ч. (А, Б) Иммуноблот. (В) Результаты ПЦР в реальном времени. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от уровня мРНК в контроле; n=3, p<0.05.
Резюмируя вышесказанное, в данной работе было впервые показано, что замедление пролиферации клеток глиобластомы под действием карнозина сопровождается снижением внутриклеточного уровня АФК, усилением экспрессии MnСОД и циклина В1, а также накоплением клеток в G2 фазе клеточного цикла. Известно, что по мере прогрессии клеточного цикла от G1 фазы к митозу (М) происходит снижение активности MnСОД, что совпадает с увеличением внутриклеточного уровня АФК и усилением пролиферации (Goswami et al 2000, Sarsour et al 2012). Усиление экспрессии MnСОД в клетках карциномы рта и поджелудочной железы усиливало формирование G2-блока под действием ионизирующего излучения (Kalen et al 2006, Fisher and Goswami 2008). Следовательно, можно предположить, что по мере прогрессии через G2 фазу и М внутриклеточный редокс-статус смещается в более окисленное состояние (Goswami et al 2000). Снижение уровня АФК и усиление экспрессии MnСОД под действием карнозина, вероятно, препятствует смещению редокс окисленное состояние, способствуя формированию G2-блока. Интересно отметить, что увеличение уровня белка циклина В1 совпадало по времени с ростом уровня MnСОД и происходило спустя 16 часов после добавления 50 мМ карнозина (Рис. 10.Б и 8.В). Это еще раз указывает на существование взаимосвязи между активацией MnСОД и регуляцией клеточного цикла.
РАЗДЕЛ 3. Сравнение антипролиферативного эффекта карнозина на клетки глиобластомы с действием его производных
У карнозина существует несколько природных производных, среди них: ацетил-карнозин (N-ацетил-в-аланил-L-гистидин), анзерин (в-аланил-3-метил-L-гистидин), гомокарнозин (у-амино-бутирил-L-гистидин). Для оценки вовлеченности отдельных групп молекулы карнозина в антипролиферативный эффект, действие карнозина сравнивали с эффектом его производных. К среде культивирования клеток U-118-MG добавляли исследуемые соединения в концентрации 40 мМ и оставляли на инкубацию. Каждые два дня в течение 6 дней клетки считали и вычисляли Td (Рис. 11).
Рисунок 11. Анзерин ингибирует пролиферацию клеток глиобластомы U-118-MG эффективнее, чем другие производные карнозина. К среде культивирования добавляли дипептиды в концентрации 40 мМ и оставляли инкубироваться. Каждые два дня в течение 6 дней клетки считали и вычисляли Td. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от Td в контроле; n=3, p<0.05.
Как следует из Рис. 11, все исследованные дипептиды приводили к удлинению Td, однако в разной степени, что свидетельствует о существовании взаимосвязи между структурой дипептида и эффективностью ингибирования пролиферации. Как следует из Рис. 11, ацетил-карнозин обладал наименее выраженным эффектом, увеличивая Td клеток глиобластомы на 3 ч по сравнению с контролем. Td клеток, обработанных гомокарнозином и карнозином, было примерно одинаковым и превышало контрольное значение на 6 - 7,5 ч. Анзерин ингибировал пролиферацию сильнее, чем остальные соединения. Td клеток, обработанных анзерином, было на 12 ч дольше по сравнению с контролем. Исходя из полученных результатов, был сделан вывод о том, что метилирование молекулы карнозина в положении 1N имидазольного кольца усиливает ингибирующий эффект на пролиферацию клеток глиобластомы.
РАЗДЕЛ 4. Эффект совместного применения карнозина и радиотерапии.
На сегодняшний день лучевая терапия - один из наиболее эффективных способов лечения глиобластомы. Для того чтобы исследовать последствия совместного применения карнозина и ионизирующего излучения, клетки обрабатывали карнозином (100 мМ) в течение 24 ч, облучали (4 Гр) и рассаживали для формирования колоний. На Рис. 12.А. представлены примеры колоний в чашках Петри, сформированных в контроле, после инкубации с карнозином и действия облучения. Подсчет количества колоний и расчет выживаемости показали, что инкубация клеток с 100 мМ карнозина приводит к снижению выживаемости клеток глиобластомы до 53% по сравнению с контролем (Рис. 12.Б). Облучение клеток при 4 Гр снижало выживаемость на 67%. Выживаемость клеток, подвергнутых совместному действию карнозина и ионизирующего излучения, составляло 17% от контроля. Таким образом, было продемонстрировано, что предварительная инкубация с карнозином снижает выживаемость клеток глиобластомы под действием ионизирующего излучения.
Рисунок 12. Предварительная инкубация с карнозином усиливает гибель клеток глиобластомы под действием ионизирующего облучения. Клетки инкубировали с карнозином (100 мМ) в течение 24 ч, облучали при 4 Гр и рассеивали в низких разведениях для формирования колоний. (А) Пример колоний, сформированных в контроле, после обработки карнозином и облучения. (Б) Выживаемость клеток, измеренная по способности формировать колонии. Звездочки обозначают статистически значимое отличие от значения выживаемости в контроле (*) или от проб, облученных при 4 Гр (**); n=3, p<0.05.
ВЫВОДЫ
1. Исследован характер воздействия карнозина на пролиферацию культур опухолевых клеток: феохромоцитомы крысы (РС-12), карциномы горла и рта (FaDu и Cal27), карциномы молочной железы (MB231) и глиобластомы человека (U-118-MG). Обнаружено, что карнозин ингибирует пролиферацию всех исследованных клеточных линий. Наиболее выраженный эффект проявлялся на клетках глиобластомы человека U-118-MG;
2. Изучено влияние карнозина на уровень АФК и активность антиоксидантных ферментов глиобластомы. Выявлено, что ингибирование пролиферации клеток глиобластомы под действием карнозина сопровождается снижением уровня АФК и увеличением активности MnСОД;
3. Исследовано воздействие карнозина на клеточный цикл клеток РС-12 и U-118-MG. Установлено, что изменения в антиоксидантной системе сопровождаются накоплением клеток в G2 фазе клеточного цикла и усилением экспрессии циклина В1;
4. Проведено сравнение антипролиферативного эффекта карнозина с действием его производных. Выявлено, что метилированное производное карнозина, анзерин, ингибирует пролиферацию опухолевых клеток эффективнее, чем карнозин;
5. Исследован эффект совместного применения карнозина и ионизирующего излучения на гибель опухолевых клеток. Обнаружено, что предварительная инкубация клеток с карнозином снижает выживаемость клеток глиобластомы под действием ионизирующего излучения.
СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах, определенных ВАК РФ:
, «Влияние карнозина и родственных соединений на пролиферацию клеток культуры феохромоцитомы крысы РС-12». // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2012; 3: 143-148. (0,52 печ. л.).Другие издания:
Khavinson V, Rybakova Y, Kulebiakin K, Vladychenskaya E, Kozina L, Arutjunyan A, Boldyrev A. “Pinealon increases cell viability by suppression of free radical levels and activating proliferative processes”.// Rejuvenation Research, 2011;14(5): 535-541. (0,81 печ. л.). Rybakova Y, Akkuratov E, Kulebyakin K, Brodskaya O, Dizhevskaya A, Boldyrev A. “Receptor-mediated oxidative stress in murine cerebellar neurons is accompanied by phosphorylation of MAP (ERK 1/2) kinase”// Current Aging Science 2012;5(3):225-230. (0,69 печ. л.).Материалы научных конференций:
Rybakova Y., Akkuratov E., Kulebyakin K., Brodskaya O., Dizhevskaya A., Boldyrev A. “Receptor mediated oxidative stress in murine cerebellar neurons is accompanied by phosphorylation of MAP (ERK 1/2) kinase”. // V Stromboli Conference on Cancer and Ageing: “The Primeval Life-Generating Molecules. Therapeutic and Aging-Reversing Properties”, p. 40. (0,06 печ. л.).СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АФК БДУ ДНК ДНКаза мРНК НАДФН ПЦР РНК РНКаза СОД Td ФИТЦ ЭП ЭТС DCFH2-DA PI Cal27 FaDu HeLa MRC-5 U-118-MG РС-12 ЭСК ЭТК | - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - | Активные формы кислорода 5-бромдезоксиуридин Дезоксирибонуклеиновая кислота Дезоксирибонуклеаза Матричная РНК Никотинамидадениндинуклеотидфосфат Полимеразная цепная реакция Рибонуклеиновая кислота Рибонуклеаза Супероксид дисмутаза Время удвоения популяции Изотиоционат флуоресцеина Эффективность посева Эмбриональная телячья сыворотка 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин-диацетат Пропидий йодид Клетки карциномы молочной железы человека Клетки карциномы горла и рта человека Клетки карциномы шейки матки человека Нормальные человеческие фибробласты Клетки глиобластомы человека Клетки феохромоцитомы крысы Эмбриональные стволовые клетки человека Клетки эмбриональной терато-карциномы человека |
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 |
