ДЕПАРТАМЕНТ ОБРАЗОВАНИЯ ГОРОДА МОСКВЫ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ГОРОДА МОСКВЫ «ШКОЛА №  1584»

МЕТОДЫ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ

Автор работы:

ученица 11 «В» класса

ГБОУ Школа № 000

Научные руководители:

учитель биологии,  химии, 

ГБОУ Школа № 000

;

ведущий научный сотрудник ГНЦ РФ ИМБП РАН

.

г. Москва, 2017

Содержание

Введение……………………………………………….....................3 Обзор литературы. Методы микроскопического исследования ……………………5 Морфологические особенности мультипотентных  мезенхимальных стромальных клеток ………….........................7 Материалы и методы……………………………………………......8 Выводы и рекомендации …………………………………………..9 Заключение………………………………………............................10 Список литературы………………………………………………...11 Приложение…...................................................................................12 Дополнительные материалы………………………………………17

Введение

  В 70-ых годах 20-ого века , основоположник современной концепции мезенхимальных стромальных клеток, впервые экспериментально доказал существование клеток-предшественников в соединительных тканях взрослого организма. Эти же клетки обозначил, как мезенхимные стволовые, что означало, что они образуются еще на стадиях эмбриогенеза и обладают потенциалом, который позволяет  клетке приобретать дифференциацию. Данные открытия были сделаны благодаря различным методам световой микроскопии, преимуществам и недостаткам которых посвящена исследовательская работа.

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

Актуальность: микроскопирование способствует получению более глубоких знаний об организации и взаимодействии мезенхимальных стромальных клеток, в связи с возможностью их повсеместного использования в медицине, а именно при изучении закономерностей развития и регенерации тканей, в целях профилактики болезней путем омолаживания и поддержания тонуса организма, а также при восстановлении утраченных органов. Например, использование искусственно выращенных популяций МСК и их дифференцированных производных, при посеве на сформированный каркас недостающего органа, полученного методом 3D моделирования и печати на нетканых материалах, позволяет  снизить риск отторжения имплантата организмом, а также сократить восстановительных период регенерации органа. Данный метод лишь недавно вошел в практику, а использование стволовых клеток в его целях возможно при возобновлении тканей мезенхимального происхождения.

Гипотеза: морфологические особенности мезенхимальных стромальных клеток и их количественные показатели можно изучить с помощью светового микроскопа.

Цель исследования: демонстрация возможностей различных видов световой микроскопии при изучении свойств фиксированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток путем улучшения качества изображения  исследуемого препарата при помощи различных технических возможностей микроскопа.

Задачи:

Охарактеризовать морфологические особенности мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток с помощью различных методик световой микроскопии. Провести микроскопирование мезенхимальных стромальных клеток методом фазового контраста и без него с использованием различных красителей или в условиях их отсутствия. Проанализировать количественные показатели МСК с использованием программы ImageJ, предварительно посчитав количество исследуемых объектов, выделив их клеточные мембраны и определив расположение ядер. Сравнить эффективность методов  и полученные данные.

Обзор литературы

Для изучения морфологии и физиологии клетки необходимы современные методы и приемы микроскопирования, которые позволят расширить границы понимания строения и процессов жизнедеятельности, исследуемого препарата.

Принцип действия светового микроскопа  заключается в том, пучок световых лучей направляется линзой конденсора через образец, затем полученное изображение увеличивается. Оно позволяет лишь в общих чертах увидеть и представить клеточное строение того или иного препарата. Можно наблюдать ядро, цитоплазму и клеточную мембрану (клеточную стенку и вакуоли в случае растений).

Изображение, наблюдаемое с помощью светового микроскопа, можно улучшить путем подкрашивания препарата,  что в дальнейшем в некоторых аспектах упрощает работу исследователя, так как объект становится более четким и ярким, хорошо заметны некоторые клеточные структуры и включения.

Еще одним способом получения качественного изображения является фазовый контраст, он хорош при наблюдении за прозрачными и блеклыми объектами, которые теряются в пределах светового поля, например, нефиксированными мезенхимальными стромальными клетками.

Принцип действия заключается в том, что световая волна, проходящая через фазовые пластины, приобретает фазовый рельеф. Эти фазовые изменения с помощью конденсорных колец  преобразуются в изменения амплитуды световой волны, что влияет на изменение яркостей, которые уже различимы глазом и которые фиксирует фотоаппарат. Следовательно, фазовый рельеф в полученном изображении отображен распределением амплитуд, то есть яркостей.

Морфологические особенности  мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток

Мезенхимальных стромальные клетки (далее МСК) – это популяция клеток-предшественников, которая поддерживает процесс кроветворения в организме, а также способна дифференцировать в последующие клеточные типы: остеобласты, хондроциты, миоциты, кардиомиоциты, адипоциты, нейроны и т. д.. [Приложение 1.] Морфология МСК схожа с морфологией фибробластов, их ядро имеет овальную форму, как правило, содержит несколько ядрышек. Хорошо развита шероховатая ЭПС, что свидетельствует  о сходстве с клетками, синтезирующими белки на экспорт. Эта особенность позволяет МСК влиять на дальнейшую дифференцировку своего же окружения,  в частности, продуцировать белковые медиаторы.

Ранее источником мезенхимальных стромальных клеток во взрослом организме считался костный мозг, однако впоследствии  такие клетки были успешно получены из других источников, к которым относятся жировая ткань, ткань пуповины и плаценты.

Мезенхимальные стромальные клетки способны не только к самообновлению, но и формированию  направленных клеточных элементов костной, жировой и хрящевой тканей, то есть большинства тканей мезенхимального происхождения.

Значительное влияние на дифференцировку МСК оказывают межклеточные контакты, под которыми подразумевается взаимодействие с функционированием соединительнотканного матрикса, плотность посадки, деятельность регуляторов эндокринной системы, а также микроокружение, которое продуцируют сами МСК, находясь рядом с другими типами клеток. 

  Факторы микроокружения и межклеточные контакты программируют функции МСК. При изучении подобного рода взаимодействия ученые прибегают к использованию методов микроскопирования, которые позволяют узнать соотношение площади ядер и цитоплазмы,

посчитать плотность посева и количество клеток с целью прогнозирования последующей дифференцировки, а также изучить общие характеристики  МСК и их особенности для применения полученных знаний при культивировании и использовании в медицинских целях.

Материалы и методы

Оборудование: Nikon Eclipse Ti-U. 

Ход работы:

1. Изучить фиксированные окрашенные и неокрашенные  препараты с применением различных способов световой микроскопии (методом фазового контраста в сравнении со снимками светового поля без каких-либо технических изменений) с использованием различных увеличений и красителей.  [Приложение 2.]

2. Выявить наиболее удобный метод микроскопирования работы с МСК.

3. На полученном изображении посчитать количество мезенхимальных стромальных клеток, выделить их в графическом редакторе и вычислить соотношение площади ядра и цитоплазмы. [Приложение 3.] На основе полученных данных составить таблицу с целью демонстрации первичных этапов в исследовании стволовых клеток. [Приложение 4.]

4. Сделать выводы, сравнив эффективность предложенных методов.

Результаты и их обсуждение

Отвечая на поставленные задачи, следует отметить следующие: 

Морфологические особенности, которыми обладают МСК, в частности способность к дифференцировке и пластичность, могут быть изучены благодаря такому методу световой микроскопии как фазовый контраст. Наблюдение за культивированной популяцией клеток без вмешательства в ее структуры красящими компонентами или ферментами, позволяет достичь в исследовании межклеточных контактов более высокую точность, что делает возможным сравнительное прогнозирование и анализ закономерностей развития МСК для последующего применения.  Микроскопирование является важнейшим видом исследования клеточной физиологии, оно играет важнейшую роль в изучении мультипотентных стромальных клеток, в чьих закономерностях дифференцировки лежит ключ к понимаю основ регенерации всего организма. 

Выводы и рекомендации

Проведя микроскопирование мезенхимальных стромальных клеток методом фазового контраста и без него с использованием различных красителей можно дать следующие рекомендации:

1. В зависимости от цели исследования, размеров МСК, силы и направленности красителей, что подразумевает под собой  их яркость и стойкость, а также целевые места основной концентрации красящих веществ, возможно совместное использование метода фазового контраста и фиксирующего окрашивания, однако, такой способ редко находит практическое применение.

2. Улучшение качества изображения препарата путем его окрашивания удобно в случае изучения фиксированных клеток. Однако использовать этот метод совместно с фазовым контрастом не рекомендуется, так как возникает большое количество помех,  в связи с которыми нужные для исследования органеллы или включения могут зрительно накладываться друг на друга, дальнейшее изучение клеток представляется невозможным. 

3. Исследования фиксированных МСК не приводят к значительным результатам, следовательно, использование токсичных красителей представляется невозможным. Для работы с нефиксированными стволовыми клетками наиболее приемлем метод фазового  контраста, который направлен на изучение живых клеток в культуре, так как он позволяет наблюдать и фиксировать процессы, происходящие в популяции на протяжении всей работы с ней.

Литературный обзор

«Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки человека при «физиологической» гипоксии in vitro» / ,

  , .-М: ГНЦРФ-ИМБП РАН, 2016.

Принципы фазово-контрастной микроскопии [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www. stormoff. ru/principy-fazovo-kontrastnoj-mikroskopii1/  Мир микроскопии [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://old. kpfu. ru/nilkto/cell/rasdel1/r1_p3_s1.html  Cоединительные ткани [Электронный ресурс]/Сообщество студентов Кировской ГМА. - Режим доступа: http://vmede. org/sait/?page=7&id=Gistologiya_atlas_kuznetsov_gemonov_2013&menu=Gistologiya_atlas_kuznetsov_gemonov_2013 Фибробласты. Функции фибробластов. Межклеточное вещество [Электронный ресурс] / Meduniver гистология. - Режим доступа: http:///Medical/gistologia/57.html  Cell Growth & Transformation Assays ( Анализы роста и трансформации клеток), Cellular Senescence Assay Kits (Комплекты для анализа клеточного старения) [Электронный ресурс] / Merck Millipore. - Режим доступа: http://www. /RU/ru/product/Cellular-Senescence-Assay, MM_NF-KAA002?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww. google. ru%2F&bd=1 

Приложение 1

   

Приложение 2

(1)

(2)

Окрашенные МСК костного мозга мыши (лат. Mus musculus),
краситель бета-галактозидаза (маркер старения клетки), увеличение 10X10.

1- Фазовый контраст.

2- Без фазового контраста.

(1)

(2)

Окрашенные МСК костного мозга крысы (лат. Rattus norvegius),
краситель кристаллвиолет, увеличение 10X10.

1- Фазовый контраст.

2- Без фазового контраста.

(1)

(2)

Полу-окрашенные МСК костного мозга мыши (лат. Mus musculus), краситель масляный красный «О!», увеличение 10X20.

1- Фазовый контраст.

2- Без фазового контраста.

Приложение 3

Обрисовка клеточной мембраны, расчет количества клеток и их ядер. (Photoshop CS5.)

Расчет площади ядер и клеток. (ImageJ.)

Приложение 4

Таблица расчетов: