Программа курса по выбору «Фундаментальные и прикладные аспекты медицинской биотехнологии» (стр. 3 )

Роль факторов роста в регуляции клеточного цикла; участие факторов роста компетенции и прогрессии в выходе клетки из состояния покоя и переходу к фазе G1 клеточного цикла; роль факторов роста в поддержинии фазы G1.

Фактор роста тромбоцитов (ТФР, или PDGF)

Тромбоциты и клетки мезенхимного происхождения – место синтеза, накопления и секреции PDGF. Особенности первичной структуры мономеров цепей PDGF. Три изоформы PDGF человека и млекопитающих - AA, BB, AB. Локализация генов А и В цепей в хромосомах человека, особенности экспрессии этих генов. Протоонкоген c-sis и онкоген v-sis кодируют В-цепь; особенности их экспрессии в нормальных и раковых клетках. Клетки соединительной ткани и крови, способные к синтезу и секреции PDGF, создают условия его локального накопления в тканях и плазме крови. Рецептор PDGF относится к суперсемейству иммуноглобулиноподобных рецепторов факторов роста. Структура рецептора PDGF; особенности организации внеклеточного домена, цитоплазматического тирозинпротеинкиназного домена. a и b типы рецепторов PDGF; степень их гомологии и особенности структуры; особенностив связывании PDGF-АА и PDGF-ВВ; лигандная специфичность a - и b-типов рецепторов. Особенности экспрессии a - и b-типов рецепторов PDGF нормальными и раковыми клетками. Димеризация рецепторов PDGF, их активация. Активация сигнальных белков – PI3-киназы; белка, активирующего ГТФ-азу, и фосфолипазы С-g, содержащих SH2- и SH3-домены. Активация протеинкиназы С с последующей активацией ядерного фактора каппа В (NF-kB), активация гена IFNa/b при участии NF-kB, аутокринная регуляция поддержания клеткой дифференцированного состояния IFNa/b.

Примеры механизмов действия PDGF как типичного фактора компетенции, способного удерживать клетки в дифференцированном состоянии. Приобретение клетками компетентности к воздействию факторов прогрессии (т. е. переходу из G0- в G1-фазу клеточного цикла) зависит от концентрации PDGF и продолжительности его действия. Примеры, когда PDGF выступает как митоген клеток мезенхимного происхождения в условиях хронического воспаления, посттравматической регенерации соединительной ткани. PDGF и модификация внеклеточного матрикса. PDGF как стимулятор хемотактической активности клеток. Влияние PDGF на поведение гладкомышечных клеток в нормальной и атеросклеротически измененной сосудистой стенке. Роль PDGF в эмбриональном развитии. PDGF и трансформация клеток. Современная модель ауто - и паракринного влияния PDGF на пролиферативное поведение клетки.

Семейство эпидермального фактора роста (ЭФР, или EGF)

Представители семейства: EGF, трансформирующий фактор роста альфа (TGF-a) и некоторые джругие.

EGF – типичный представитель этого семейства. Работы S. Cohen (гг.) по выделению и изучению биологического действия EGF. Структура нативной формы EGF. Структура внутриклеточного предшественника EGF. Структура гена EGF и особенности его тканевой экспроссии.

Трансформирующий фактор роста альфа - TGF-a – эмбриональная форма EGF (G. Todaro ,1978). Секреция TGF-a карциномными и эмбриональными клетками. Рецептор EGF – трансмембранный гликопротеид; особенности организации внеклеточного домена; цитоплазматический домен – типичная тирозинпротеинкиназа.

Протоонкоген c-erbB кодирует рецептор EGF, а онкобелок v-erbB – это «усеченный» вариант рецептора EGF. Особенности экспрессии генов c-erbB и v-erbB. Лигандная специфичность рецепторов EGF. Особенности димеризации рецептора EGF.

EGF – яркий представитель факторов прогрессии. Представление о механизмах внутриклеточной передачи сигнала после взаимодействия EGF с рецептором. Примеры митогенного влияния EGF на различные типы клеток; EGF стимулирует переход клеток из фазы G1 в фазу S клеточного цикла. Роль EGF в ингибировании синтеза коллагена I в костной ткани. Влияние EGF на экспрессию ядерных протоонкогенов c-fos и c-myc; значение для процессов дифференцировки. Раковые клетки не синтезируют EGF, но экспрессируют либо нормальный, либо “усеченный” рецепторы EGF; TGF-a является их лигандом.

Секреция проEGF эндокринными железами желудочно-кишечного тракта. Гомеостатическая роль EGF в поддержании целостности эпителиальной выстилки желудочно-кишечного тракта. Механизм действия EGF в поддержании целостности кишечного эпителия и поддержании полярности и целостности эпителия дистальных отделов почечных канальцев.

Семейство фибробластного фактора роста (ФФР, или FGF)

Девять представителей семейства FGF. Исследования D. Gospodarowicz по выделению и изучению структуры кислого и основного FGF. Современая номенклатура представителей семейства FGF. Структура FGF-1 (aFGF) и FGF-2 (bFGF); отсутствие сигнальных последовательностей у FGF-1, -2 и –9, в отличие от FGF-3 – FGF-8. Проблемы понимания механизма секреции FGF-1 и FGF-2. FGF-1 и FGF-2 секретируют эмбриональные и взрослые клетки; FGF-3-8 – эмбриональные, трансформированные и раковые клетки. Локализация генов FGF1-9 в геноме человека; особенности их экспрессии. Множественность изоформ представителей семейства FGF; разнообразие способов возникновения изоформ. Интернализация экзогенного FGF-1 и FGF-2 клеткой. Обнаружение стабильных фрагментов FGF-1 и –2 в ядре; возможная их роль в ядре.

Особенности связывания FGF с рецепторами. «Высокоаффинные» сигнальные рецепторы с тирозинпротеинкиназной активностью и «низкоаффинные» рецепторы – различные по структуре трансмембранные гепарансульфатпротеогликаны. Структура четырех типов «высокоаффинных» рецепторов, наличие изоформ у каждого из типов; значение каждой из иммуноглобулиноподобных петель экстрацеллюлярного домена и межпетлевых участков в «высокоаффинном»связывании лиганда с рецептором; роль степени гликозилирования для функциональной активности связывания рецептора с лигандом. Структура цитоплазматического тирозинпротеинкиназного домена.

Лигандная специфичность сигнальных рецепторов FGF-1-4; представленность определенных сочетаний типов рецепторов на различных типах клеток; современные представления и гипотезы, объясняющие биологическую роль столь большого разнообразия изоформ лигандов и рецепторов.

Структура «низкоаффинного» рецептора FGF, относящегося к семейству синдеканов - трансмембранных гепарансульфатпротеогликанов (ГсПГ); роль корового белка в секреции и закреплении этого типа рецептора в плазматической мембране. Шесть сайтов связывания с гепарансульфатными цепями; роль связывания цитоплазматического домена с кортикальным актином. Роль ГсПГ-рецептора в депонировании FGF, защите от протеолитической деградации; участие ГсПг-рецептора в индукции ди - и олигодимеризации «высокоаффинных» рецепторов. Модель, предложенная Schlessinger, (1996) для объяснения функций «низкоаффинного» рецептора, как презентирующего лиганд «высокоаффинному» рецептору. Активация сигнального рецептора. Важнейшая активируемая сигнальная молекула в клетке – PLC-g; ее активация обуславливает множество функции FGFs – в эмбриональной индукции, дифференцировке, хемотаксисе, но не в индукции пролиферации. В стимуляции пролиферации (под действием FGF-2) главным участником является активированная протеинкиназа С. Ее участие в активации генов быстрого, или первичного, ответа (переход из G0 в G1 фазу). Экспрессия второй группы - генов медленного ответа, непосредственно связанная с работой первой группы, приходится на середину – конец G1 фазы и обеспечивает переход к S –фазе – это гены определенных типов циклинов, негистоновых хромосомных белков, синдекана и некоторых других. Особенности влияния FGF на культивируемые клетки. Роль FGF-1 и-2 в ангиогенезе опухолей (J. Folkmann). Роль FGF-2 в миграции и пролиферации эндотелия и гладкомышечных клеток при нарушении целостности сосудистой стенки. Значение FGF-2 в развитии рестенозов сосудистых трансплантатов и протезов; возможные методы и подходы для борьбы с рестенозами. FGF-1 и –2 – как обязательные участники острых и хронических воспалений и посттравмвтического восстановления тканей.

Суперсемейство трансформирующего фактора роста бета

(ТФРбета, или TGFbs)

Девятнадцать представителей суперсемейства TGFb включает четыре близких семейства: TGFb, Vg/DPP/BMP (вегетализирующий фактор роста, определяющий дорзовентральную ось/фактор морфогенеза кости), Inhibin/Activin (ингибин/активин – факторы контроля дифференцировки и индукции мезодермы), MIS (фактор регрессии мюллерова протока). Эволюционная консервативность представителей суперсемейства TGFbs. Краткая характеристика биологического действия представителей каждого семейства, многообразие изоформ. TGFb - характерный представитель суперсемейства. Структура молекулы TGFb, особенности синтеза и секреции. Латентный предшественник TGFb. Образование гомо - и гетеродимеров. Особенности депонирования предшественника в экстроцеллюлярном матриксе, поступление и транспорт в плазме крови; молкулы, участвующие в его депонировании и транспорте. Представления об ограниченном протеолизе предшественника. Шесть типов рецепторов TGFb. Ser/Thr-протеинкиназа – сигнальный тип рецептора TGFb, представленность на различных типах клеток у млекопитающих. Краткая характеристика молекулярной организации основных четырех типов сигнальных рецепторов: Daf-1, TGFb-II-R, Act-IIB-R, Act-II-R; структура и гомология киназных доменов; изоформы этого типа рецепторов; спорные вопросы о роли различных участков экстрацеллюлярного домена. Лиганд-препрезентирующий тип рецепторов - бетагликан III типа, а также эндоглин. Структура презентирующих рецепторов, их молекулярное разнообразие. Образование рецепторных комплексов между двумя типами рецепторов, необходимое для связывания лиганда с сигнальным рецептором. Современные представления о механизмах презентации лиганда и связывания с сигнальным рецептором. Экспериментальные данные о механизмах передачи сигнала сигнальным рецептором; возможные кандидаты в субстратные белки, их многообразие; роль эффекторных цитоплазматических молекул - SMAD в передаче информации в ядро; структура SMAD, их разнообразие; трудности интерпретации результатов.

TGFbs – как типичные факторы компетенции; сочетание пара - и аутокринных путей регуляции, современные представления. Бифункциональность биологического действия TGFb - с одной стороны, временные ингибиторы пролиферации эпителиальных клеток и клеток мезодермального и мезенхимного происхождения, выступающие как мощные факторы дифференцировки и индукторы синтеза компонентов внеклеточного матрикса, а с другой – в сочетании с работой других факторов – как активатора пролиферации, что обеспечивает выход клеток из состояния покоя и переходу в активный клеточный цикл. Различие биологического действия TGFb in vitro и in vivo. Современные представления о молекулярных механизмах действия TGFb как ингибитора пролиферации. Роль TGFb в ингибировании роста и пролиферации раковых клеток эпителиального происхождения, представление о механизме такого ингибирующего действия. Роль представителей семейства TGFb в хемотаксисе, в перестройке костной ткани. Роль TGFbs в дифференцировке IL-2-зависимых Т-лимфоцитов, влияние на поведение макрофагов – роль TGFbs в реализации воспалительных реакций.

Представители суперсемейства TGFb - важнейшие регуляторы индукции мезодермы; регуляторы дифференцировки. Роль в определении паттерна симметрии зародышей позвоночных и морфогенеза зародышевых тканей. Возможные последствия нарушения таких механизмом и развитие позвоночных животных.

Семейство фактора некроза опухолей альфа (ФНОальфа, или TNFa)

Краткая историческая справка о биологических эффектах, наблюдаемых у экспериментальных животных и человека при действии TNFa. Природа эндотоксина и лимфотоксина; TNFa - это кахектин; TNFb - лимфотоксин, сравнительный анализ их первичной структуры. Секретируемая и трансмембранная формы TNFa, особенности секреции. Роль карбонильного и аминоконцевого участков в молекуле TNFa для ее биологического действия; генноинженерные экспериментальные данные по этому вопросу. Различия в биологических эффектах трансмембранной и секретируемой форм TNFa. Особенности локализации и структуры гена TNFa. Индукторы экспрессии гена TNFa. Главный источник TNFa у млекопитающих – макрофаги, другие типы нормальных и раковых клеток, которые являются продуцентами TNFa. Роль IFN-g и M-CSF в продукции TNFa макрофагами; другие молекулы-мишени для этих индукторов; роль активации транскрипционных факторов NF-kB и AP-1 в активации гена TNFa. Два типа рецепторов TNFa; особенности их экспрессии на различных типах клеток у млекопитающих. Структура рецепторов TNFa гомология с другими представителями суперсемейства рецепторов TNFa-R. Особенности первичной структуры цитоплазматических доменов p80 TNFa-R и p60 TNFa-R, роль в различиях биологических эффектов, вызванных взаимодействием лиганда с определенным типом рецептора. Структура генов рецепторов TNFa и особенности регуляции их экспрессии, роль интерферонов. Слабая перекрываемость сигнальных каскадов, вызванных взаимодействием мембранносвязанной и растворимой формами лиганда с каждым из типов рецепторов у нормальных и раковых клеток. TNFa - типичный представитель факторов компетенции; TNFa - как трофический фактор. Плейотропный эффект действия TNFa на нормальную клетку. Роль различных Ser/Thr-протеинкиназ и MBP-киназ в реализации передачи сигнала у разных типов клеток. Роль продуктов активации определенных факторов транскрипции (каскад активаций) в усилении транскрипционной активности клетки. Ассоциация цитоплазматического домена TNFa-R с казеинкиназой 1 и некоторыми подмембранными Ser/Thr-протеинкиназами, а также с кислой и нейтральной сфингомиелинидазой. Каскад активаций сфингомиелинидаз и последующая активация церамид-активируемой протеинкиназы, протеинкиназы Сzeta и протеинфосфатаз, активации NF-kB и усиление экспрессии c-myc и c-jun. Продукция клеткой церамида и механизм ингибирования ее роста, вызванная действием TNFa. Возможные механизмы активации клеточной пролиферации при действии TNFa. “Домен смерти” в составе цитоплазматического домена двух типов рецепторов TNFa и его роль. Возможный молекулярный механизм участия TNFa в супрессии генов, вовлеченных в рост раковых клеток; ингибирование гена Rb, усиление экспрессии генов р53 и TNFa.

Биологические эффекты TNFa: TNFa как аутокринный фактор дифференцировки макрофагов и гранулоцитов и активации макрофагов в усилении продукции иммунорегуляторов и медиаторов воспаления. Роль TNFa в активации гранулоцитов при остром воспалении; ее молекулярный механизм. Роль TNFa в кахексии, анорексии и ожирении. Использование TNFa для клинических целей – современное состояние вопроса.

Протоонкогены и онкогены

Определение терминов “протоонкоген” и “онкоген”. Основные процессы в жизни клетки куда вовлечены продукты протоонкогенов –регуляция контроля нормального роста и пролиферации, течения клеточного цикла, а также дифференцировки. Мутации и другие нарушения в структуре или работе протоонкогенов – главные причины появления признаков онкотрансформации клетки. Экспериментальные данные, позволяющие разделить онкогены на несколько групп: иммортализующие клетку, снижающие потребность клетки к экзогенным факторам роста; изменяющие характер взаимодействия клетки с субстратом, влияющие прямо или опосредованно на контроль пролиферации. Трансгенные мыши – прекрасная модель для изучения роли онкогенов в онкогенезе. Модели, используемые в экспериментах in vitro для идентификации новых онкогенов.

Открытие онкогенов; вирусные онкогены. Структура генома ретровирусов; особенности интеграции вирусного генома в геном клетки-хозяина. Деление ретровирусов на два класса. Современные представления об активации онкогенов через ретровирусную трансдукцию; активация онкогенов путем инсерции вируса. Выявление онкогенов в раковых клетках человека. Хромосомные транслокации (характерные примеры) и места выявления онкогенов в раковых клетках; использование различных технологий по трансфекции ДНК, выделенных из трансформированных или раковых клеток в слаботрансформированные клетки линии NIH 3T3; химический канцерогенез и выявление онкогенов. Примеры химерных генов, механизмы их возникновения. Амплификация протоонкогенов и онкогенез; их выявление и прогностическое значение при диагностике и лечении некоторых типов рака человека.

Эволюционная консервативность протоонкогенов и их продуктов у эукариот. Группы вирусных онкогенов и их продуктов гомологичные таковым протоонкогенам: факторов роста; рецепторов, лишенных протеинкиназной активности; тирозинпротеинкиназ, интегрированных в плазматическую мембрану, т. е. рецепторов факторов роста; цитоплазматических и подмембранных тирозинпротеинкиназ; семейство мембранносвязанных G-белков; семейство белков GFF (guanine nucleotide exchange proteins); цитоплазматических Ser/Thr-протеинкиназ; семейство ядерных белков.

Краткая характеристика молекулярных и фенотипических изменений в клетке, происходящих вследствие гиперактивации или гиперпродукции продуктов тех онкогенов, которые гомологичны основным группам протоонкогенов: факторам роста, на примере v-sis; рецеторам факторов роста с тирозинпротеинкиназным (ТПК) доменом на примерах v-erbB, v-fms, met, trk, ras, v-kit, bck; рецепторам факторов роста без ТПК домена, на примере mas нерецепторных ТПК – на примере v-scr, v-fes, v-fos, v-yes и lck; белков с активностью ГТФаз –ras-онкогенов;нарушение основных молекулярных механизмов, наблюдаемых при передаче сигнала в клетке с участием ras p21; ядерных онкобелков, участвующих в контроле экспрессии важнейших групп генов регулирующих клеточный цикл, пролиферацию, дифференцировку и адгезию. Структура протоонкогенов и протоонкобелков fos, jun, myc; гомо - и гетеродимерные белки; «лейциновые застежки» и “basic domain’ы”, их роль во взаимодействии протоонкобелков с соответствующими участками геномной ДНК. Особенности изменений структуры онкогенов v-fos, v-jun и других и влияние таких мутаций на их экспрессию и поведение у онкотрансформированных клеток in vitro и in vivo.

Онкогены и онкобелки – как диагностические и прогностические маркеры различных типов рака у человека; их значение для ранней дианостики рака и химиотерапии.

Клеточный цикл

Определение “клеточный цикл”, “митотический (пролиферативный) цикл”. Создание метода авторадиографии, разделение интерфазы на G1-, S - и G2-периоды. М-период. Параметры клеточного цикла - по модели цикла, разработанной Pardee A. и соавт. (1975, 1978). Относительная стабильность и варьирование продолжительности периодов (фаз) клеточного цикла клеток млекопитающих. Примеры, когда не выявляются G1, G2+G2, S+G1+G2. Эксперименты, показывающие, что самостоятельность механизма контроля определенной фазы цикла относительна и является составной частью общего механизма контроля цикла, жестко контролирующего нормальную последовательность прохождения фаз клеточного цикла. Регуляция интенсивности клеточной пролиферации зависит от G1- и G2-фазы. Рост и дифференцировка клеток связаны с изменением интенсивности их пролиферации. Разделение тканей млекопитающих на три группы (по Leblond C. P., 1964,1982) в зависимости от темпа их пролиферации: неразмножающиеся (static) популяции; популяции с очень низким темпом пролиферации (expanding); обновляющиеся (renewing) популяции. Общая характеристика обновляющихся тканей, определение понятий «стволовые клетки» (stem cells), “коммитированные клетки”, “клетки-предшественники”, “зрелые клетки” – сходства и различия. Понятия “пролиферативный пул”, “пролиферативный потенциал”, “лаг-период клеточного цикла”, “ пролиферативный период”. Наблюдения и эксперименты, свидетельствующие о периоде покоя (G0, или R) в клеточных системах многоклеточных. Выход клеток в покой по завершении М-фазы, либо - S-фазы; сходство и различия клеток вышедших в покой и составляющих т. наз. R1- и R2- популяции; примерв таких популяций. Понятие «углубление в покой»; эксперименты, показывающие, что клетки по разному углублены в покой. Выход клеток из состояния покоя; экспериментальные модели in vitro и in vivo; современные представления о механизмах выхода клеток из покоя; роль факторов роста. Разнообразие механизмов умножения генома в митотическом цикле, примеры таких клеточных популяций у человека и млекопитающих. Современная модель клеточного цикла эукариот; понятие “точек перехода” (рестрикции, R) в G1- и G2-фазе; теоретические предпосылки и экспериментальные модели поиска молекул-регуляторов, координирующих вступление и прохождение каждой из фаз клеточного цикла; общие теоретические представления о механизме контроля клеточного цикла эукариот.

Механизм молекулярного контроля клеточного цикла

Краткий анализ результатов исследований по генетическому контролю клеточного цикла дрожжей и поиску молекул, контролирующих прохождение клеточного цикла в овогенезе и раннем развитии амфибий. Консервативность механизмов контроля клеточного цикла эукариот. Работа L. Hartwell и P. Nurse () на дрожжах Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe – открытие гомологичных генов (cdc2 и CDC28) и их продуктов, участвующих в реализации программы контроля прохождения клеткой фаз клеточного цикла у этих двух видов с различным ядерным (жизненным) циклом. Предложенная этими авторами фундаментальная идея клеточной биологии об организации молекулярного контроля клеточного цикла. Точки “Start” в клеточном цикле у S. cerevisiae и S. pombe и “Checkpoint control”. Совпадение точки “Start” и точки перехода (R) в клетках дрожжей и млекопитающих. Открытие фактора промотирующего переход к М-фазе (MPF) в овогенезе и раннем развитии амфибий (Masul H.,et al., 1971). Очистка MPF и изучение его димерной структуры; в состав MPF входит циклин-зависимая киназа (cdk) - каталитическая субъединица, и активирующая киназу субъединицу – циклин; cdks – Ser/Thr-потеинкиназы; циклины – уникальная группа белков, контролирующая способность cdk, связываться и фосфорилировать определенные белки-мишени. Особенности экспрессии этих субъединиц в ходе клеточного цикла. Основа контрольного механизма клеточного цикла – периодическое объединение, активация и распад коемплексов циклин-cdk. Парадигма Murray A. (1989) о контроле клеточного цикла у эукариот как цикле cdk1 (в частности p34cdc2 дрожжей), активация соответствующей киназной субъединицы необходима как для прохождения определенной фазы цикла, так и для осуществления точек перехода из G1- в S-фазу и из G2- в М-фазу. У дрожжей S. cerevisiae и S. pombe киназная субъединица р34 – CDC28 и cdc2 – единственный и главный «контролер» в клеточном цикле. Уникальность сочетаний паттерна экспрессии и активаций cdks, характерных для каждой фазы клеточного цикла у млекопитающих. Семейство циклинов; первичная структура циклинов D, E, B, A, H, “cyclin box” и роль “destruction box” в молекуле циклина. Конформационные изменения молекул циклина и cdk в ходе их взаимодействия с (образование MPF). Разнообразие циклинов млекопитающих и дрожжей; особенности паттерна их экспрессии в зависимости от фазы клеточного цикла. Молекулярная модель активации cdk; G1-, S-, G2-циклины и их партнеры – соответствующие cdk в клеточном цикле млекопитающих. Регуляция циклин-зависимой протеинкиназы осуществляется путем ее фосфорилирования и дефосфорилирования; участники этих процессов. Гены, участвующие в контроле клеточного цикла гаплоидных дрожжей S. pombe: cdc2 (Ser/Thr-протеинкиназа, p34cdc2), cdc13 (циклин М-киназы, р60), cdc25 (специфическая фосфатаза), suc1 (p13), wec1 (Ser/Thr-протеинкиназа), nim1 (протеинкиназа, негативный регулятор wec1), Mo15 (активирующая киназа), cdc10; особенности экспрессии этих генов; структура и функция продуктов этих генов в контроле цикла S. pombe. Отличительные особенности течения и регуляции клеточного цикла у диплоидный дрожжей S. сerevisiae - p34cdc28 остается главным и единственным регулятором клеточного цикла диплоидных дрожжей, но увеличивается число типов циклинов, участвующих в регуляции более сложного по течению клеточного цикла S. сerevisiae.

Ингибиторы циклин-зависимых киназ; семейство INK4 белков и семейство CIP/KIP белков; их структура, особенности экспрессии в ходе клеточного цикла. Субстраты-мишени для активированных cdk – т. наз. «М-киназы» (MPF): H1-гистон, MAP-киназы, MAP-белки, белки ядерной ламины; особенности структуры этих белков и их фосфорилирования для осуществления перехода из G2- в M-фазу. Субстраты-мишени “Start kinase” (определенные комплексы циклин-cdk) необходимые для перехода из G1- в S-фазу: Rb-белок, s6 и некоторые факторы, участвующие в репликации ДНК. Особенности этапов фосфорилирования Rb-белка; высвобождение фактора транскрипции E2F; его роль в усилении транскрипции генов необходимых для осуществления S-фазы, а также экспрессии гена циклина Е, последующего образования активного комплекса циклин Е-cdk2, необходимого для преодоления точки перехода (R1) из G1- в S-фазу; роль комплекса циклин А-cdk2 в инактивации фактора E2F.

Протеолиз и регуляция клеточного цикла. Деградация циклина В обеспечивает необратимый переход от метафазы к анафазе. Структура протеосом (26S комплексы); убиквитин, его структура, селективно-сигнальная роль убиквитина при его связывании с белком, впоследствии подвергающемся деградации в протеосоме. Убиквитин-активирующие ферменты. “Destruction box” – особый мотив в молекуле циклина В, распознаваемый убиквитином. АРС-комплексы, их структура и состав, роль АРС-комплексов в убиквитинилировании циклинов В в мета - анафазе и циклинов в G1-фазе.

Общая схема молекулярных механизмов, участвующих в регуляции клеточного цикла млекопитающих.

Генная инженерия

Основные понятия генной инженерии: клонирование, трансформация, вектор. Основные свойства векторов, используемых в генной инженерии. Векторы замещения. Инсерционные векторы.

Векторы на основе плазмид. Участок ori, селективные маркеры, полилинкер. Система селекции с использованием альфа цепи бетта-галактозидазы. Компетентные клетки. Сравнительная характеристика различных штаммов. Бактериофаг М13. Эффективность трансформации, ее зависимость от длины плазмиды. Векторы на основе фага лямбда. Векторы ВАС, РАС, YAC. Области применения рассматриваемых векторов.

Система модификации-рестрикции бактерий. Рестриктазы второго типа. Изошизомеры. Другие ферменты, используемые в генной инженерии: ДНК-лигазы, ДНК-полимеразы, полинуклеотидкиназа фага Т4, фосфатазы. Способы встраивания чужеродной ДНК в вектор. Геномные клонотеки. Представительность клонотеки, минимальное число анализируемых клонов.

Анализ нуклеиновых кислот с помощью электрофореза. Разрешающая способность геля. Агарозные и акриламидные гели. Методы визуализации нуклеиновых кислот в геле. Конформация молекул нуклеиновой кислоты при электрофорезе. Денатурирующий электрофорез. Капиллярный электрофорез. Импульс-электрофорез.

Плавление ДНК. Температура плавления, интервал плавления. Гибридизация. Примеры «+» и «-»-гибридизации. Мембраны для иммобилизации нуклеиновых кислот. Получение ДНК - и РНК - зондов для гибридизации, Саузерн - и Нозерн-гибридизация. Использование изотопов и флюоресцентных красителей. Создание геномных клонотек, покрывающих геном. Скрининг геномных клонотек.

Картирование. Физические карты, генетические карты. Масштаб физической и генетической карты. Рекомбинационные единицы. Клонотеки, представляющие отдельные хромосомы. "Шаги" и "прыжки" по хромосоме. Энциклопедии генов.

Определение последовательности нуклеотидов. Метод полимеразной достройки ДНК с использованием модифицированных нуклеотидов-терминаторов (метод Сэнгера), метод специфической химической модификации оснований с последующим расщеплением ДНК (метод Максама-Гильберта). Автоматическое секвенирование. Определение последовательностей нуклеотидов длинных фрагментов ДНК.

Полимеразная цепная реакция. Области применения. Основные параметры реакции. Термостабильные ДНК-полимеразы.

Подходы к картированию геномов высших эукариот. Полиморфизм длины рестрикционных (лат. фрагментов (RFLP), ДНК-маркирующие сайты (STS). Различные нуклеотидные повторы и их использование для картирования. Микросателлитные маркеры. Геномная дактилоскопия. Определение полной последовательности нуклеотидов организмов. Программа «Геном человека».

Создание клонотек кДНК. Методы скрининга клонотек кДНК: гибридизация нуклеиновых кислот, иммунологическая детекция специфических антигенов, гомологичная рекомбинация, отбор по продуцированию биологически активных молекул. Определение точки начала транскрипции. Метод «футпринтинга».

Основы биоинформатики: сравнение последовательностей нуклеотидов, сравнение последовательностей аминокислотных остатков. Гомология. Идентификация функциональных областей генома на основе нуклеотидного состава. Базы данных. Знание полной последовательности нуклеотидов генома: что это дает?

Клонирование новых генов. Открытые рамки считывания. Переход к последовательности аминокислотных остатков. Анализ экзон - интронной структуры. Определение хромосомной локализации. Поиск регуляторных элементов. Предсказание функции клонированного гена по первичной структуре.

Позиционное клонирование. Ген-кандидат. Анализ сцепления. Генетические маркеры. Прямая и непрямая генная диагностика.

Генная инженерия высших эукариот. Модельные организмы. Генная терапия: задачи, подходы, векторные системы. Дополнительная и заместительная генная терапия. Гомологичная рекомбинация. Регуляция экспрессии внесенных генов. Морально-этические проблемы генной терапии. Оценка и возможное уменьшение биологического риска, связанного с созданием и распространением рекомбинантной ДНК.

Получение продуцентов интересующих белков. Векторные системы. Способы оптимизации продуцентов. Выделение и очистка слитных белков. Получение белков в активной форме. Посттрансляционная модификация.

Взаимосвязь генов в клетке. Генные сети. Методы изучения экспрессии генов. Подходы к изучению экспресси генов на уровне целой клетки. Array, EST. Проблемы интерпретации полученных результатов.

Протеом.

Молекулярные основы наследственной патологии

Анализ генома

Геном человека. Различные уровни анализа генома: цитогенетический, молекулярно-цитогенетический, молекулярно-биологический. Хромосомный набор, морфология хромосом. Дифференциальная окраска хромосом (G-, C-, R-, Q-, T-, Ag-). Анализ хромосом на разных стадиях митоза: метафазные хромосомы, раннеметафазные хромосомы, прометафазные хромосомы, профазные хромосомы. Гетерогенность G-окраски гомологичных хромосом на разных стадиях митоза. Молекулярная организация хромосомы: нуклеосомная упаковка ДНК, хроматиновое волокно и его упаковка, петли хроматина, сестринские хроматиды. Взаимосвязь упаковки хроматина и дифференциального окрашивания хромосомы: R-петли, Q-петли, районы прикрепления петель хроматина к каркасу, эухроматин, факультативный гетерохроматин, структурный гетерохроматин