Программа курса по выбору «Фундаментальные и прикладные аспекты медицинской биотехнологии» (стр. 4 )

Временные параметры репликации хромосом Хромосомные аномалии - классификация, механизмы и примеры. Численные аномалии хромосом: три - и тетраплоидии, анеусомии: трисомии хромосом 21 (синдром Дауна), 18 (синдром Эдвардса), 13 (синдром Патау), Х (синдромы ХХХ и Клайнфельтера), Y, моносомия Х (синдром Шерешевского-Тернера). Структурные аномалии хромосом: реципрокные и нереципрокные транслокации, робертсоновские транслокации, тандемные транслокации, инсерции прямые и инвертированные, делеции терминальные и интерстициальные, дупликации прямые и инвертированные, кольцевые хромосомы, изохромосомы моно - и дицентрические. Ломкость хромосом - фрагильные участки. Биодозиметрия

Операционные уровни в цитогенетике: светооптический, молекулярный. Молекулярная цитогенетика - методы: флуоресцентная гибридизация in situ, ПЦР на хромосомах, сравнительная геномная гибридизация, спектроскопический анализ хромосом. Операционные уровни в молекулярной биологии: крупные фрагменты ДНК, гены, мРНК, экзоны, нуклеотиды.

Методы анализа ДНК: анализ сцепления, электрофорез в пульсирующем поле, молекулярное клонирование, электрофорез в агарозном геле, ПЦР, методы поиска мутаций, секвенирование. Композиция генома человека: ядерный и митохондриальный геномы. Ядерный геном: гены и генные последовательности, кодирующие и некодирующие ДНК, псевдогены, фрагменты генов, нетранслируемые последовательности, повторяющиеся последовательности. Клиническая цитогенетика и онкоцитогенетика - база картирования генов наследственных заболеваний человека

.

Стратегии картирования генома

Стратегия «Функциональное клонирование»: геноспецифические олигонуклеотиды, специфические антитела, скрининг антител, экспрессионные библиотеки кДНК, функциональная комплементация. Список наследственных заболеваний человека, картированных с использованием этой стратегии.

Стратегия «Позиционное клонирование». Алгоритм исследования. Генетическое картирование, анализ сцепления: генетические маркеры, генетические карты, анализ гаплотипов, генетическое расстояние (сантиморган), кроссинговер, позитивный и негативный лод-балл, мультилокусное сцепление.

Делеционное картирование и клонирование точек разрыва. Микродиссекция и клонирование фрагментов ДНК. Анализ потери гетерозиготности и сравнительная геномная гибридизация. Физическое картирование определенного района, физические маркеры: искусственные дрожжевые хромосомы, клоны на основе вирусной и бактериальной ДНК, радиационные гибриды, хромосомоспецифические ДНК-библиотеки, контиги клонов, флуоресцентная гибридизация на нити ДНК, секвенированные маркерные участки (STS).

Тонкое генетическое картирование: анализ рекомбинаций, неравновесие по сцеплению. Идентификация гена в определенном районе: скрининг кДНК-библиотек с использованием геномных клонов, кДНК селекция, нозерн-блоттинг на панели тканей, зоо-блоттинг, идентификация CpG-островков, экзон-треппинг, компьютерный анализ последовательности: поиск гомологии, предсказание экзонов, поиск мотивов и сигнальных последовательностей, выявление мутаций.

Стратегия «Ген-кандидат»: «позиционно-независимый ген-кандидат», «позиционный ген-кандидат». Усредненные характеристики гена: размеры генов, экзонов, интронов, организация промоторных районов, гены внутри генов, антисмысловые генные последовательности.

ДНК-диагностика - практический подход

Основные типы мутаций: нуклеотидные замены, инсерции, делеции, хромосомные аномалии. Полиморфизмы ДНК (SNP). Методы косвенной ДНК-диагностики: анализ полиморфизма длин рестрикционных (лат. фрагментов, анализ полиморфизма микросателлитных последовательностей. Методы прямой ДНК-диагностики: множественная ПЦР, анализ однонитевого конформационного полиморфизма (SSCP), анализ гетеродуплексов (HA), денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE), градиентный по температуре гель-электрофорез (TGGE), химическое расщепление неспаренных участков (CCM), энзиматическое расщепление неспаренных участков, белок-усеченный тест (PTT), секвенирование. Анализ функционального состояния ДНК: метилчувствительная ПЦР, метилспецифическая ПЦР, метилспецифический фингерпринтинг. Анализ однородительской изодисомии. Анализ крупных структурных перестроек ДНК: электрофоретический анализ в пульсирующем поле, дозовый блот-гибридизационный анализ. Анализ экспансии тринуклеотидных повторов.

Классификация мутаций по функции: потеря функции, приобретение новой функции, изменение дозы гена. Классификация мутаций по структуре: миссенс-мутации, нонсенс-мутации, мутации сдвига рамки считывания. Мутации сайтов сплайсинга: механизмы возникновения мутаций сплайсинга, донорные и акцепторные сайты сплайсинга, сайты ветвления, криптические сайты сплайсинга. Номенклатура и правила записи мутаций. Характерные мутации при распространенных наследственных заболеваниях.

Молекулярные основы наследственной патологии

Картирование и клонирование генов EXT1 и EXT2 при множественной экзостозной хондродисплазии: синдром Лангера-Гидиона, трихо-рино-фаланговый синдром, множественная экзостозная хондродисплазия, делеция хромосомы 8q24.1, делеция хромосомы 11р12, анализ сцепления, критические рекомбинации, клонирование точек разрыва, делеционное картирование, дозовый блот-гибридизационный анализ, анализ длин рестрикционных фрагментов, контиги космидных клонов, микросателлитные ДНК-маркеры, уникальные ДНК-маркеры, скрининг кДНК-библиотек, 5’- и 3’- RACE, нозерн блоттинг-гибридизация, зоо-блоттинг, анализ ДНК-последовательности по базам данных, определение экзон-интронной организации генов, скрининг и секвенирование мутаций. потеря гетерозиготности и мутации во вторичных хондросаркомах.

Картирование и клонирование генов PAX6 и WT1 при синдроме WAGR. Синдром аниридии, нефробластомы, аномалий мочеполового тракта, умственной и физической задержки развития, изолированная аниридия, изолированная нефробластома, делеция хромосомы 11р13, клонирование точек разрыва, делеционное картирование, контиг космидных клонов. радиационные гибриды, флуоресцентная гибридизация на хромосомах, дозовый блот-гибридизационный анализ, дозовая ПЦР, экзон-интронная организация генов, скрининг и секвенирование мутаций.

Мышечные дистрофии Дюшенна и Беккера: история картирования и клонирования гена, экзон-интронная организация гена, варианты дистрофина в результате альтернативного сплайсинга в различных тканях, делеции гена дистрофина, молекулярная диагностика аномалий гена дистрофина.

Муковисцидоз: история картирования и клонирования гена. экзон-интронная организация гена, частота и спектр мутаций, методы детекции мутаций, гены-модификаторы, влияющие на течение заболевани.

Ретинобластома: история картирования и клонирования гена, экзон-интронная организация гена. белковый продукт гена и его функция. взаимодействие pRB с другими генами в цепи регуляции клеточного цикла, частота и спектр герминальных мутаций, потеря гетерозиготности и мутации в опухоли, функциональная инактивация гена в опухоли, методы детекции мутаций.

Множественная эндокринная неоплазия, типы 2А и 2В, семейный медуллярный рак щитовидной железы и синдром Гиршпрунга: история картирования и клонирования гена RET, экзон-интронная организация гена, белковый продукт гена и его функция, частота и спектр герминальных мутаций при МЭН2А и 2В и медуллярном раке, частота и спектр герминальных мутаций при синдроме Гиршпрунга, структурные перестройки гена RET при папиллярной карциноме щитовидной железы, типы химерных генов на основе RET, приобретение новой функции, методы детекции химерных генов. Создание диагностических протоколов.

Болезни экспансии

Повторяющиеся последовательности генома. Классификация.

Мультигенные семейства: классические генные семейства (рРНК), генные семейства, кодирующие большие консервативные домены (PAX-гены, гомеобоксные гены), генные семейства, кодирующие короткие консервативные мотивы (DEAD-мотив), генные суперсемейства (гены иммуноглобулинов, комплекса гистосовместимости), кластерированные генные семейства (различные формы псевдогенов, глобиновый кластер), РНК-кодирующее генное семейство.

Внегенные повторяющиеся последовательности и мобильные элементы: тандемные повторы: сателлитная ДНК и центромерный гетерохроматин, минисателлитная ДНК (теломерное семейство, гипервариабельное семейство), микросателлитная ДНК, рассеянные повторы: SINE (Alu-повторы), LINE (Kpn-повторы), ME, THE-1, RTLV.

Механизмы возникновения структурной патологии и мутаций в повторяющихся районах генома: проскальзывание неспаренной нити ДНК (репликационное проскальзывание), неравный кроссинговер, неравный обмен сестринских хроматид, генная конверсия.

Примеры генетических заболеваний, связанных с районами повторяющихся последовательностей: вело-кардио-фациальный синдром, синдром Вильямса, синдром Смита-Магениса, азооспермия (DAZ), синдром Шарко-Мари-Тус. Синдром Мартина-Белл, как пример структурной и функциональной патологии: ломкость хромосомы Xq27.3, экспансия CGG-повтора, механизмы, методы ДНК-диагностики, метилирование повтора и промоторной области, область отсроченной репликации и нестабильность микросателлитов, ремоделирование хроматина. Другие болезни, связанные с динамическими мутациями: хорея Гентингтона, болезнь Кеннеди, спино-церебральные атаксии (SCA1-7), миотоническая дистрофия, миоклональная эпилепсия.

Днк-диагностика в онкологии

Двухударная теория канцерогенеза Кнудсона. Онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста.

ДНК-диагностика моногенных и дигенных наследственных онкологических заболеваний: р53 и синдром Ли-Фраумени, АРС и семейный полипоз, АТМ и атаксия-телангиоэктазия, BRCA1, BRCA2 и наследственный рак молочной железы, NF1, NF2 и нейрофиброматоз, р16 и наследственная меланома, VHL и синдром фон Хиппель-Ландау.

ДНК-диагностика маркеров неблагоприятного прогноза: гиперэкспрессия/инактивация определенных генов в различных типах опухолей, клинико-биологические типы нейробластомы, молекулярная эволюция рака толстого кишечника и опухолей мозга.

ДНК-диагностика микрометастазов, РТ-ПЦР - как основной метод, определение экспрессии опухолеспецифических маркеров в периферической крови, тирозиназа при меланоме, тирозинкиназа при нейробластоме, цитокератин 19 при раке молочной железы.

Диагностика полиморфизмов ДНК, определяющих риск развития злокачественных новообразований: полиморфизмы гена ароматазы и риск развития рака молочной железы, полиморфизмы андрогенового рецептора и риск развития рака предстательной железы, полиморфизмы генов NAT1, PADPRP и риск развития рака легкого.

Эпигенетическая регуляция экспрессии генов в опухоли: инактивация гена hMLH при карциноме желудка, инактивация генов GSTP1, BRCA1, ER при раке молочной железы, инактивация MGMT, DAP, р16 при раке легкого.

Определение маркеров, свидетельствующих о злокачественном процессе на ранних стадиях, в плазме крови, метилирование р16, Е-кадгерина, BRCA1, мутации р53, потеря гетерозиготности по маркерам хромосом 3р, 9р, 17р, 18q. Исследование генных регуляторных цепей в опухоли. Разработка диагностических протоколов. Эпигенетические механизмы регуляции генной экспрессии и наследственная патология.

Структура хроматина и механизмы ее определяющие, нуклеотидные «сторожевые» районы, метилирование цитозинов, ацетилирование/деацетилирование гистонов, белковые комплексы, осуществляющие модификацию хроматина.

Эффект положения. Классические примеры: мозаичный эффект положения у дрозофилы, аниридия и ген PAX6, цефалополисиндактилия Грейга и ген GLI3, акроцефалосиндактилия и ген TWIST, синдром Ригера и ген PITX2, кампомелическая дисплазия и ген SOX9, Х-сцепленная глухота и ген POU3F4, голопрозэнцефалия и ген sonic hedgehog, XY-реверсия пола ген SRY, эктродактилия и ген DSS1, лице-плече-лопаточная мышечная дистрофия и ген FRG1, азооспермия и ген DAZ, механизмы ЭП, конформация ДНК, деацетилирование гистонов, эухроматиновый домен, гетерохроматиновый домен, время-зависимая экспрессия генов, энхансеры, сайленсеры, инсуляторы, конкуренция за регуляторный элемент, инактивирующий белковый комплекс.

Импринтинг. Определение. Примеры импринтинга: трансплантация пронуклеусов, андрогенетические зиготы, гиногенетические зиготы, пузырный занос, тератома, андроид, гиноид, синдром Шерешевского тернера, делеция хромосомы 15q11.2, синдром Прадера-Вилли, синдром Ангельмана, синдром Миллера-Дикера, синдром ДиДжорджи, синдром «кошачьего крика», болезни экспансии, синдром Видеманна-Беквита, дупликация хромосомы 11р15.5. Моноаллельная экспрессия, метилирование, однородительская изодисомия, импринтированный ген, ген-импринтор, центр импринтинга, потеря импринтинга, глобальное деметилирование, кластеризация импринтированных генов, асинхронность репликации, онтогенетическая регуляция импринтинга, тканевая регуляция импринтинга, повторяющиеся последовательности, нетранслируемая РНК, антисмысловая РНК, метилспецифическая ПЦР, метилчувствительная ПЦР, микросателлитный анализ, инактивирующее влияние структурного гетерохроматина, метилспецифические белки, консервативность импринтинга.

Генная терапия и избранные главы по вирусологии

Генная терапия (ГТ) – новое направление современной биомедицины. Природа заболеваний, являющихся объектом ГТ. Наследственные болезни, обусловленные мутациями или отсутствием существенных генов. Онкологические заболевания, вызванные перестройкой и другими модификациями генома. Молекулярно-биологические и медицинские предпосылки создания и развития ГТ. Геномика. Реализация международного проекта «Геном человека». Достижения в структурно-функциональном анализе нормальных и дефектных генов. Локализация генов. Современные методы выделения и поддержания in vitro клеток человека различной специфичности. Методы создания функционирующих клеток с измененными свойствами. Генетически модифицированные организмы – трансгенные животные. Основные подходы и приемы генной терапии. Перенос и экспрессия целевых генов в тканях больных. Дополнительная и заместительная генная терапия. Гомологичная рекомбинация. Регулируемая экспрессия внесенных генов. Подавление экспрессии активированных онкогенов. Подавление развития инфекционных заболеваний методами ГТ за счет переноса и экспрессии неприродной рекомбинантной ДНК и РНК.

Генная терапия соматических клеток

Искусственные железы. Идеология этого подхода. Экспрессия в клетках больного цитокинов, гормонов, ферментов для восполнения соответствующего дефицита. Генная терапия моногенных и полигенных заболеваний. МЗ – дефект одного гена. Примеры. Дополнительная ГТ МЗ. успешное лечение иммунодефицита, вызванного недостаточностью ADA. ПЗ – множественный склероз, волчанка, ревматоидный артрит. Заместительная и дополнительная генная терапия. Преимущества заменительной терапии. Трудности осуществления и способы их преодоления. Модельные эксперименты на перевиваемых клетках и лабораторных животных. LoxP – cre система. Преимущества и недостатки дополнительной генной терапии. Примеры клинического применения ДГТ: миодистрофия Дюшена, муковисцидоз; заболевания, вызванные дефицитом гормонов или цитокинов. Генная терапия злокачественных и вирусных заболеваний. 2/3 одобренных ГТ протоколов направлены на лечение злокачественных заболеваний. Основной подход – усиление иммунного отввета за счет усиления иммуногенности раковых клеток. Способы достижения. Антисмысловые РНК и антисмысловые олигонуклеотиды. Молекулярные основы действия антисмысловых последовательностей нуклеиновых кислот. Подавление на уровне трансляции. РНКазная деградация. Рибозимы. Основной молекулярный механизм действия рибозимов. 2 основных типа рибозимов. Подавление онкогенов рибозимами. Генная терапия репродуктивных клеток. Исправление гентических дефектов в репродуктивных клетках. Направленное изменение генома. Мораторий на ГТ репродуктивных клеток человека. Морально-этические проблемы генной терапии. Возможность направленного изменения генома – разрешительные органы, контролирующие органы. Проблема принятия решения. Церковь и генная терапия. Биологический риск. Оценка риска. Создание рекомбинантной ДНК и контроль за ее распространением, использованием и уничтожением. Спонтанное возникновение генетически модифицированных вирусов и микроорганизмов – возможные издержки генноинженерных технологий, используемых при ГТ.

Методы переноса и экспрессии генов

Невирусные методы переноса генов. «Химические методы» переноса экспрессируемых генов. Ca-фосфатная и DEAE-декстрановвая трансфекции. Принцип действия, использование при трансгенозе. Липосомы, типы липосом, использование при ГТ. Ограничения этих методов. «Физические методы» переноса экспрессируемых генов. Электропробой. Преимущества и недостатки. Баллистические методы доставки ДНК. Инъекция, струйный метод. Использование при ДНК-вакцинации. Вирусные методы переноса генов. Общая характеристика методов. Вирусы, используемые для конструирования векторов. Преимущества. Примеры использования. Векторы на основе ДНК-содержащих вирусов. Основные характеристики вируса осповакцины. История использования вируса осповакцины в медицинской практике,. жизненный цикл и особенности строения генома. Существенные и несущественные гены. Векторы на основе осповакцины. Клонирование в векторах на основе вируса осповакцины. Использование гомологичной рекомбинации при клонировании генов в векторах на основе осповакцины. Векторы на основе аденовирусов. Структура аденовирусного генома. Ранние и поздние гены. Стратегия модификации генома. Жизненный цикл аденовирусов. Конструирование векторов на основе аденовирусов. Способы увеличения емкости этих векторов. Высокая иммуногенность аденовирусных векторов. Использование в целях генной терапии. Риск, связанный с их использованием. Адено-ассоциированный вирус, структура генома, жизненный цикл. Особенности вируса. Интеграция в определенный участок 19 хромосомы человека. Конструирование векторов на основе адено-ассоциированного вируса. Системы переноса терапевтических генов в рекомбинантных векторах на основе ААВ. Использование этих векторов в генной терапии. Преимущества и недостатки. Ограничения при использовании. Примеры использования в ГТ. Векторы на основе вирусов герпеса. Особенности структуры генома вирусов герпеса. Жизненный цикл вирусов герпеса. Конструирование векторов на основе вирусов герпеса и их использование в генной терапии. Удаление несущественных генов вируса и змаена их «терапевтическими генами». Использование при внесении генов в нервные клетки. Ограничения. Векторы на основе РНК-содержащих вирусов. Ретровирусные векторы. Особенности жизненного цикла. Обратная транскриптаза. Молекулярный механизм действия ОТ. Классификация ретровирусов. Принципы классификации ретровирусов. Вирусы группы MLV. Спумавирусы (пенящие вирусы). Лентивирусы (HIV 1,2). Ретровирусы B-типа (MMTV). Ретровирусы группы лейкозов человека и крупного рогатого скота. Простые и сложные ретровирусы. Особенности структуры геномов простых и сложных ретровирусов. Жизненные циклы простых и сложных ретровирусов. Взаимодействие белков оболочки вируса с клеточными рецепторами. Тропизм вирусов. Экотропные, амфотропные и ксенотропные вирусы. Онкогенные ретровирусы. Природный перенос генов от одних клеток другим ретровирусами. Природа клеточных протоонкогенов. Захват геномом ретровирусов онкогенов. Переход протоонкогенов в активированные онкогены. Конструирование векторов на основе ретровирусов. (Вирусы группы лейкозов мышей, лентивирусы, пенящие вирусы). Цис - и транс-последовательности генома ретровирусов. Их функции. Емкость ретровирусных векторов. Упаковывающие клетки (УК). Принципы конструирования УК. УК первого, второго и третьего поколения. Псевдотипирование. Использование псевдотипирования для повышения титра. Ретровирусные векторы в генной терапии. Использование; преимущества и недостатки. Емкость векторов. Включение в состав ретровирусных векторов участков генома вирусов другой природы и регуляторных элементов генома человека. Регулируемая экспрессия. Настоящее и будущее генной терапии. Перспективы развития. Благо или зло. Первые 10 лет генной терапии. Конкретные достижения. Основные направления развития ГТ. Клонирование человека. Методические основы клонирования. Клонирование животных. Человечество перед выбором: аргументы за и против. Клонирование тканей и органов в целях трансплантации. Ответственность исследователей и врачей. Готово ли общество к клонированию?

Культивирование и методы исследования

эукариотических клеток (практические занятия)

Использование культур эукариотических клеток в биологии и медицине. Преимущества работы с культурами клеток.

Среды для культивирования клеток. Сбалансированные солевые растворы. Естественные среды, среды с определенным составом и среды с определенным составом с добавлением естественных компонентов. Роль сыворотки при культивировании клеток. Ростовые среды. Поддерживающие среды. Газовая фаза.

Посуда и оборудование, используемые для культивирования клеток. Условия культивирования клеток. Принципы стерильной работы. Методы стерилизации. Контроль бактериального загрязнения.

Основные принципы культивирования клеток млекопитающих. Первичные и пассируемые культуры. Суспензионные культуры. Монослойные культуры. Субкультивирование. Факторы, лимитирующие рост клеток. Стабильные клеточные линии, характеристика, особенности. Анализ кривой роста. Методы получения клеточных суспензий: механические, использования протеаз, хелатирующих агентов. Подсчет живых клеток в камере Горяева. Методы выделения лимфоцитов. Культивирование лимфоцитов. Митогены.

Сохранение и оценка качества клеток. Замораживание клеток. Размораживание и оценка выхода клеток. Основные подходы к масштабированному культивировыанию клеток млекопитающих в биотехнологических целях.

Техника получения моноклональных антител. Принципы соматической гибридизации. Подбор партнерских линий. Способы иммунизации. Гибридизация. Основы селекции, селективные среды. Методы тестирования моноклональных антител. Клонирование клеток. Кондиционированныые среды. Фидерный слой. Способы наращивания и выделения моноклональных антител. Гетерологичные гибридомы. Использование моноклональных антител.

Использование радиоактивных изотопов в клеточной культуре. Типы ядерных распадов, используемые в клеточной биологии. Единицы измерения радиоактивности. Принципы измерения бета-радиоактивности. Принципы измерения гамма-радиоактивности. Изотопы, используемые в биологических исследованиях, их характеристики. Радиоавтография. Фотографическая эмульсия. Возникновение скрытого изображения. Проявление. Область применения радиоавтографии. Использование двойной метки. Сочетание радиоавтографии с другими методами (иммуноцитохимией, гистологическим окрашиванием и др.). Применение радиоавтографии при изучении клеточного цикла. Метод «меченых митозов». Метод «разведения метки» для изучения пролиферативного поведения клеток. Определение пролиферативного пула клеточной популяции.

Иммуноцитохимия, принцип метода. Условия успешного проведения иммуноцитохимических исследований. Сохранность и доступность антигена. Антитела и специфичность окрашивания. Визуальзация реакции антиген-антитело. Иммунофлуоресцентные методы. Иммуноферментные методы. Прямой метод Кунса. Непрямой метод Веллера и Кунса. Метод пероксидазы-антипероксидазы (ПАП). Метод гаптенового сэндвича. Авидин-биотиновые методы. Мечение при помощи коллоидного золота. Окрашивание по двум антигенам одновременно. Использование лектинов, ингибиторов. Область применения иммуноцитохимических методов.

Практические занятия по генной инженерии

Масштабы и методы анализа геномов. Основные этапы молекулярно-генетических исследований, связанных с анализом геномов: 1) конструирование клонотек, поиск отдельных генов и определение их нуклеотидной последовательности; 2) установление взаимного расположения клонированных фрагментов и воссоздание строения более протяженных участков генома; 3) подходы к исчерпывающей структурной характеристике геномов любых размеров. Клонотека (библиотека) генома. Карты генома - физические и генетические. Энциклопедии генов. Масштабы разрешения методов молекулярного клонирования и генетического картирования.

Клонирование ДНК. Общие принципы конструирования библиотек. Поиск и характеристика индивидуальных клонов. Скрининг библиотек методом гибридизации нуклеиновых кислот. Отбор клонов с помощью гомологичной рекомбинации. Использование иммунологической детекции для идентификации нужных клонов в экспрессирующих библиотеках. Другие методы скрининга экспрессирующих библиотек. Системы вектор – хозяин. Основные типы векторов для клонирования фрагментов чужеродной ДНК и размножения их в E. coli : бактериофаг l, космиды, плазмиды, бактериофаг M13. Соотношение размеров молекул различных векторов и вставок (клонирующая емкость векторов). Основные свойства плазмидных векторов. Клонирование в плазмидах. Расщепление ДНК рестрицирующими эндонуклеазами. Проведение реакции рестрикции. Обработка рестрицированной ДНК щелочной фосфатазой. Лигирование ДНК.

Электрофорез ДНК в агарозном геле. Общие принципы метода. Основные параметры, определяющие скорость миграции ДНК в агарозном геле при электрофорезе - размер молекул ДНК, концентрация агарозы, конформация ДНК, напряженность электрического поля, состав оснований и температура. Приготовление агарозного геля и нанесение проб. Метод визуализации ДНК в агарозных гелях с помощью окрашивания ее флуоресцирующим красителем - бромистым этидием. Извлечение ДНК из агарозного геля.

Трансформация E. coli плазмидной ДНК. Общие принципы метода. Выбор конкретного штамма Е. coli. Приготовление основных сред и растворов для трансформации. Стандартная методика трансформации. Оценка результатов трансформации. Частота (эффективность) трансформации. Доля компетентных клеток.

Выделение плазмидной ДНК. Сравнительные характеристики различных методов выделения плазмидной ДНК. Растворы для выделения плазмидной ДНК. Микрометод выделения плазмидной ДНК.

Гибридизация ДНК, иммобилизованной на фильтрах, с радиоактивными зондами. Основные принципы метода. Растворы для блоттинга и гибридизации ДНК. Перенос ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр. «Предгибридизация» фильтра в растворе, компоненты которого насыщают его неспецифические ДНК-связывающие центры. Виды ДНК-зондов для гибридизации. Способы включения метки в ДНК. Ник-трансляция ДНК. с помощью ДНК-полимеразы I (E.coli). Включение метки в 5'-концы ДНК с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4. Гибридизация на фильтрах по Саузерну. Отмывка от несвязавшейся метки. Параметры гибридизации и отмывки. Время полуренатурации зонда. Радиоавтография.

Полимеразная цепная реакция. Общая схема экспоненциального увеличения количества копий ДНК в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Параметры реакции. Температурные циклы ПЦР, включающие последовательные стадии денатурации, отжига и элонгации цепей ДНК. Компоненты реакции. Основные типы ДНК-матрицы. Принципы подбора праймеров. Оптимизация условий ПЦР.